粒細(xì)胞集落刺激因子對自發(fā)性高血壓大鼠心室重構(gòu)的調(diào)控

王雪婷，羅 明

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200065)

高血壓通過壓力負(fù)荷及一系列神經(jīng)內(nèi)分泌因素，引起心室重構(gòu)，增加心力衰竭的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，盡管近年來對血壓的控制率有所提高，心室重構(gòu)的高血壓患者發(fā)生心力衰竭事件的仍然較高。粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，GCSF)動(dòng)員骨髓干細(xì)胞，在治療急性心肌梗死、保護(hù)心臟、預(yù)防心力衰竭的實(shí)驗(yàn)研究方面取得一定進(jìn)展［1］，本實(shí)驗(yàn)以自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)為動(dòng)物模型，通過早期反復(fù)大劑量皮下注射G-CSF動(dòng)員骨髓干細(xì)胞，觀察大鼠心臟功能及病理改變，探討G-CSF對高血壓早期心室重構(gòu)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組用藥

SHR大鼠飼養(yǎng)于海軍醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物房(SPF級)，雄性，體質(zhì)量 250～300 g，每籠 5只，恒溫(24℃ ～25℃)，恒濕(50% ～60%)，自由取食攝水，人工照明，陰暗交替各12 h。

30只SHR大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。粒細(xì)胞集落刺激因子組(G-CSF組):14 d為1個(gè)周期，周期內(nèi)前5 d連續(xù)皮下注射G-CSF(杭州九源基因工程有限公司生產(chǎn))50 μg/(kg·d)，生理鹽水稀釋成0.5 ml，后9 d不用藥物，連續(xù)進(jìn)行4個(gè)周期;假性實(shí)驗(yàn)組(NS組):14 d為1個(gè)周期，周期內(nèi)前5 d連續(xù)皮下注射生理鹽水0.5 ml/d，后9 d不用藥物，連續(xù)進(jìn)行4個(gè)周期;空白對照組(空白組)不給藥。每天同一時(shí)間(上午9點(diǎn)開始)大鼠皮下注射藥物。實(shí)驗(yàn)干預(yù)期間，每周檢測血壓、體質(zhì)量。血壓采用無創(chuàng)尾套間接測量法，每次測血壓連續(xù)測量3次，取平均值。

1.2 超聲心動(dòng)圖檢查

8周飼養(yǎng)結(jié)束，將大鼠用3%戊巴比妥鈉以1 ml/kg腹腔注射麻醉，臥位固定，左胸前區(qū)剃毛，用頻率為17.5 Hz探頭對大鼠進(jìn)行超聲檢查，測量指標(biāo)包括室間隔厚度(interventricular septal thickness，IVST)、左室舒張末期內(nèi)徑及左室收縮末期內(nèi)徑，左室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)由超聲儀自動(dòng)計(jì)算輸出。各指標(biāo)均在連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期測量后取其平均值。

1.3 病理學(xué)檢查

1.3.1 組織包埋、脫水、切片、染色 取經(jīng)乳頭肌橫斷左室心肌組織，標(biāo)本編號后放入包埋框沖水3 h，然后將包埋框取出置入包埋機(jī)進(jìn)行垂直石蠟包埋，包埋結(jié)束后將標(biāo)本轉(zhuǎn)入脫水機(jī)進(jìn)行自動(dòng)脫水、組織透明及透鈉過程如下:70%乙醇3 h，75%乙醇3 h，80%乙醇3 h，90%乙醇 3 h，95%乙醇 2 h，95%乙醇 2 h，100%乙醇2 h，100%乙醇2 h，二甲苯2 h，二甲苯2 h，石蠟1.5 h，石蠟1.5 h。脫水結(jié)束標(biāo)本切成3 μm厚玻片標(biāo)本，每塊組織各制作玻片標(biāo)本2張，一張行H-E染色，一張行Masson染色。染色后封片。

1.3.2 取材與固定 干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用3%戊巴比妥鈉以1 ml/kg腹腔注射麻醉，解剖大鼠，解剖過程注意觀察胸腹各臟器外觀有無異常。迅速摘取心臟，去除心房、大血管和心包組織，留取心室，冰生理鹽水沖洗干凈，清潔濾紙吸干水分用電子天平稱心室濕重，組織用4%多聚甲醛溶液固定。

1.3.3 圖像分析 圖像于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，照片采用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行分析。在H-E染色下，觀察左心室心肌的基本病理變化。在Masson染色下左心室心肌標(biāo)本測定心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)和血管周圍膠原面積(perivascular collagen area，PVCA)。切片上隨機(jī)選取10個(gè)視野，通過灰度調(diào)節(jié)區(qū)別膠原和非膠原成分，膠原容積分?jǐn)?shù)為膠原面積與心肌面積的比值，取平均值，其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積。血管周圍膠原面積為每一個(gè)標(biāo)本測量5支呈橫切面壁內(nèi)小動(dòng)脈的周圍膠原面積與血管腔面積的比值，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示。3組統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析(ANOVA，LSD)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體質(zhì)量及血壓指標(biāo)

干預(yù)前各組SHR大鼠體質(zhì)量、收縮壓及舒張壓指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.5)。8周干預(yù)后各組SHR大鼠體質(zhì)量、收縮壓及舒張壓指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.5)，見表1。

表1 干預(yù)前、后各組體質(zhì)量、收縮壓、舒張壓比較Tab.1 Comparison of body weight，systolic blood pressure，diastolic blood pressure before and after intervention(±s)

1 mmHg=0.133 kPa

BW/g SBP/mmHg DBP/mmHg組別干預(yù)前 干預(yù)后 干預(yù)前 干預(yù)后 干預(yù)前 干預(yù)后G-CSF組 282±13 377±10 186±4 198±5 144±5 153±4 NS組 282±11 384±12 184±6 200±5 142±4 154±5空白組279±11 383±14 185±6 199±6 141±3 155±5

2.2 心室質(zhì)量/體質(zhì)量、心超室間隔厚度、左室短軸縮短率比較

實(shí)驗(yàn)干預(yù)8周后，解剖結(jié)果顯示，G-CSF組較NS組及空白組心室質(zhì)量/體質(zhì)量比值(VW/BW)增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);心臟彩超顯示GCSF組較NS組及空白組IVST增加(P＜0.05)，F(xiàn)S增加(P＜0.05)，提示G-CSF促進(jìn)自發(fā)性高血壓大鼠心室肥厚，增強(qiáng)心肌收縮力，維持心臟功能。NS組與空白組相比，VW/BW、IVST、FS差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示生理鹽水皮下注射刺激對大鼠心室結(jié)構(gòu)改變及功能無明顯影響，見表2。

表2 心室質(zhì)量/體質(zhì)量比值、心超室間隔厚度、左室短軸縮短率Tab.2 Ventricular weight/body weight，interventricular septal thickness，fractional shortening in 3 groups(±s)

表2 心室質(zhì)量/體質(zhì)量比值、心超室間隔厚度、左室短軸縮短率Tab.2 Ventricular weight/body weight，interventricular septal thickness，fractional shortening in 3 groups(±s)

與 G-CSF 組相比，(1)P ＜0.05，(2)P ＜0.01

組別 (VW/BW)/‰ IVST/mm FS G-CSF 組 4.34 ±0.16 3.01 ±0.10 61.86 ±5.63 NS 組 4.06 ±0.18(2) 2.88 ±0.11(1) 49.16 ±5.32(2)空白組 4.10 ±0.20(2) 2.84 ±0.13(1) 49.51 ±5.23(2)

2.3 H-E 染色

心肌組織的H-E染色顯示，G-CSF組心肌纖維較NS組及空白組致密，排列相對整齊;NS組與空白對照組較為接近，心肌纖維排列紊亂，部分甚至斷裂，見圖1。此結(jié)果與解剖及心超結(jié)果一致，提示GCSF促進(jìn)自發(fā)性高血壓大鼠心肌良性肥厚，對抗后負(fù)荷。

圖1 大鼠心肌H-E染色Fig.1 Rat myocardial H-E staining(×100)

2.4 Masson 染色

光鏡下可見心肌細(xì)胞核呈藍(lán)褐色，胞漿呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。NS組及空白組SHR心肌細(xì)胞間及血管壁周圍可見大量膠原纖維增生，較G-CSF組明顯增加，見圖2。NS組與空白組間心肌CVF和PVCA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，G-CSF組與另2組相比CVF、PVCA明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。提示G-CSF改善心肌纖維化。

圖2 大鼠心肌Masson染色Fig.2 Rat myocardial Masson staining(×100)

表3 心肌CVF和PVCA變化Tab.3 Changes of collagen volume fraction and perivascular collagen area (±s)

表3 心肌CVF和PVCA變化Tab.3 Changes of collagen volume fraction and perivascular collagen area (±s)

與對照組相比，(1)P ＜0.01

組別 例數(shù)CVF/% PVCA/%G-CSF 組 10 4.82 ±0.55(1) 0.85 ±0.12(1)NS 組 10 6.26 ±0.54 1.17 ±0.10空白組 10 6.12 ±0.53 1.14 ±0.15

3 討 論

3.1 改善高血壓左室及血管重構(gòu)的意義

心臟重構(gòu)是高血壓最重要的靶器官損害，心臟的重構(gòu)主要表現(xiàn)為心肌肥厚缺血缺氧與心肌間質(zhì)纖維化，而心肌間質(zhì)纖維化在心力衰竭的發(fā)生過程中更為重要，歐洲高血壓協(xié)會(huì)(European Society of Hypertension，ESH)指南中指出，高血壓患者心血管系統(tǒng)總體風(fēng)險(xiǎn)評估，不僅取決于血壓水平，還取決于是否存在臨床或亞臨床靶器官損害，亞臨床靶器官損害是高血壓患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子［2］。對高血壓導(dǎo)致的靶器官損害進(jìn)行早期診斷，有針對性地盡早治療，逆轉(zhuǎn)或延緩損傷，具有決定性意義。

3.2 高血壓心血管重構(gòu)的機(jī)制

高血壓通過影響機(jī)體內(nèi)皮功能、腎素血管緊張素系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等，造成心血管重構(gòu)［3］，血壓的升高是高血壓心血管重構(gòu)的始動(dòng)因素，由于后負(fù)荷的增加，心肌代償肥大，以滿足周圍循環(huán)的灌注，但是肥大的心肌克服阻力做功較多，相對容易缺血缺氧，心肌細(xì)胞往往排列紊亂，而原發(fā)性高血壓本身內(nèi)皮功能受損，細(xì)胞凋亡加速，心肌及周圍毛細(xì)血管減少，肥厚的心肌更加缺血缺氧，乳酸堆積，由于毛細(xì)血管的減少，不利于心肌代謝不良產(chǎn)物排出，加之高血壓神經(jīng)體液內(nèi)環(huán)境的紊亂，心肌周圍膠原更容易發(fā)生纖維化，造成室壁運(yùn)動(dòng)僵硬，順應(yīng)性減低，心臟收縮力減弱，以致周圍灌注不足，而循環(huán)灌注的損傷更加重了內(nèi)環(huán)境的失調(diào)，在持續(xù)的后負(fù)荷作用下，缺血缺氧且活動(dòng)度差的心肌排列更加紊亂，甚至出現(xiàn)斷裂，失代償?shù)男氖冶诜票?，呈現(xiàn)心力衰竭。

3.3 G-CSF調(diào)節(jié)高血壓心血管重構(gòu)的機(jī)制

G-CSF通過心肌表面受體G-CSFR發(fā)揮直接保護(hù)作用，抑制心肌缺血再灌注損傷［4］，G-CSF還可通過干擾SDF-1與其受體CXCR4結(jié)合，動(dòng)員骨髓干細(xì)胞致外周血，G-CSF動(dòng)員的CD34+細(xì)胞包含未成熟及成熟的內(nèi)皮及心肌先祖細(xì)胞，體外培養(yǎng)證實(shí)可分化為內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞，動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)直接輸入心肌，可參與心肌損傷再生修復(fù)，減弱梗死導(dǎo)致的電傳導(dǎo)減慢，減小梗死瘢痕面積，提高梗死區(qū)周圍灌注，增加毛細(xì)血管密度，增加梗死區(qū)心室壁厚度，阻止膠原沉積，保留心室?guī)缀谓Y(jié)構(gòu)，減弱電生理重構(gòu)，減少心律失常發(fā)生可能，提高左室射血分?jǐn)?shù)，延緩心衰［5］。

3.4 G-CSF調(diào)控高血壓心血管重構(gòu)的有效性

在大量心肌梗死動(dòng)物模型中已經(jīng)證實(shí)，連續(xù)5 d皮下注射G-CSF 50 g/(kg·d)可有效動(dòng)員大鼠骨髓干細(xì)胞，促進(jìn)毛細(xì)血管生成，減少心肌纖維化，改善心臟射血分?jǐn)?shù)及遠(yuǎn)期預(yù)后，本實(shí)驗(yàn)將G-CSF在心肌梗死過程中表現(xiàn)出的保護(hù)作用，轉(zhuǎn)化至高血壓模型中觀察，由于高血壓心血管重構(gòu)自然病程較長，進(jìn)展緩慢，考慮一次或短期的用藥可能不足以產(chǎn)生有益效果，且G-CSF對于SDF-1/CXCR4信號軸的激活以動(dòng)員骨髓干細(xì)胞，在開始用藥后14 d達(dá)到峰值，21 d時(shí)作用已經(jīng)明顯減弱［6］，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性設(shè)計(jì)通過8周內(nèi)連續(xù)4個(gè)周期，每個(gè)周期前5 d連續(xù)50 g/(kg·d)皮下注射G-CSF，反復(fù)動(dòng)員骨髓干細(xì)胞?？紤]等已進(jìn)展至心力衰竭再應(yīng)用G-CSF，收益可能減小，本實(shí)驗(yàn)選取10周齡SHR大鼠，在心血管重構(gòu)早期反復(fù)給予大劑量G-CSF動(dòng)員骨髓干細(xì)胞，以觀察其對自發(fā)性高血壓大鼠心血管重構(gòu)的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用G-CSF大鼠心臟較對照組肥厚，左室短軸收縮率提高，心肌收縮力增強(qiáng)，心臟纖維化減少。與傳統(tǒng)意義上改善心臟重構(gòu)理解不同的是，G-CSF不是減輕心臟肥厚，而是增加了心室質(zhì)量/體質(zhì)量比值及室間隔厚度，眾所周知高血壓心室肥厚是預(yù)后的不良因素，分析肥厚的心肌造成預(yù)后不良的原因，是由于肥厚的心肌缺血缺氧，加之心肌間質(zhì)纖維化的束縛，順應(yīng)性下降，容易發(fā)生失代償進(jìn)而心力衰竭，而如前所述G-CSF動(dòng)員骨髓干細(xì)胞可增加心肌修復(fù)，促進(jìn)毛細(xì)血管生成，改善供血，并且減少纖維化，而纖維化才是造成室壁活動(dòng)僵硬舒張減退的更重要的引起心力衰竭的因子，因此可以理解為自發(fā)性高血壓大鼠接受G-CSF動(dòng)員骨髓干細(xì)胞后，心肌在壓力負(fù)荷下代償性良性增生肥厚，且結(jié)合病理學(xué)結(jié)果，G-CSF組心肌細(xì)胞排列較整齊，而NS組及對照組心肌排列紊亂，甚至部分出現(xiàn)斷裂，更進(jìn)一步的心超結(jié)果也證實(shí)了G-CSF組肥厚心肌功能較對照組好，左室短軸收縮率提高，心肌收縮力增強(qiáng)，與大樣本高血壓患者橫斷面研究中顯示高血壓肥厚性重構(gòu)與收縮及舒張功能減退及心室內(nèi)壓力增高相關(guān)不同［7］，G-CSF組并沒有表現(xiàn)出疾病過度進(jìn)展出現(xiàn)的肥厚心肌運(yùn)動(dòng)力差、收縮及舒張功能減退的情況，而心肌收縮及舒張功能的減退，必然導(dǎo)致周圍灌注不足，加重內(nèi)環(huán)境的紊亂，反過來加重心衰。

心臟在壓力、容量負(fù)荷及損傷等情況下，為維持心臟功能，代償出現(xiàn)適應(yīng)性肥厚，生理性肥厚表現(xiàn)為正常的心臟形態(tài)與加強(qiáng)的心臟功能，而病理性肥厚表現(xiàn)為間質(zhì)纖維化、細(xì)胞死亡的增多及心臟功能的喪失［8］。與運(yùn)動(dòng)體育訓(xùn)練出現(xiàn)的心臟肥厚相似，GCSF介導(dǎo)的心肌肥厚，沒有證據(jù)提示加速疾病進(jìn)展，且伴隨心肌毛細(xì)血管增加，血供改善，心肌收縮力增強(qiáng)，心臟纖維化減少，室壁活動(dòng)度改善，潛在改善舒張功能，是適應(yīng)性良性肥厚，這種肥厚能否成為一種額外儲備延緩遠(yuǎn)期心力衰竭尚待進(jìn)一步研究。此外，由于血壓的升高才是心臟及血管重構(gòu)纖維化的始動(dòng)因素，本實(shí)驗(yàn)對血壓并未控制，采取自然狀態(tài)，可以推測，良好的控制血壓條件下，心肌不需要克服巨大的后負(fù)荷阻力，早期反復(fù)大劑量G-CSF誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞對于心臟的保護(hù)作用，可能存在更良好的受益。

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