小鼠腹腔水液體積檢測方法建立及腎陽虛模型小鼠水負荷的評價

李 靜，楊 勇，容 蓉

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟南 250355）

小鼠腹腔水液體積檢測方法建立及腎陽虛模型小鼠水負荷的評價

李 靜，楊 勇，容 蓉

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟南 250355）

目的建立小鼠腹腔水液體積的檢測方法并評價腎陽虛模型小鼠的水負荷狀況。方法選取正常小鼠12只，根據(jù)“阿基米德原理”改進實驗方法測量小鼠的腹腔水液體積，對其腹腔水液體積測量的穩(wěn)定性進行評價；選取正常小鼠5只，利用小鼠腹腔水液檢測方法對其進行線性關(guān)系考察；將SPF級昆明種雄性小鼠30只，隨機分為正常組和腎陽虛模型組，腎陽虛模型組上午按0.08mg/10g腹腔注射苯甲酸雌二醇注射，正常組腹腔注射相同劑量的大豆油，下午兩組均腹腔注射1mL的生理鹽水造成水負荷，連續(xù)15d。結(jié)果該測量方法的穩(wěn)定性和線性關(guān)系考察均取得了良好的效果；與正常組相比，造模后體重顯著性降低（P＜0.01），肛溫顯著性降低（P＜0.01），趾溫差異無顯著性（P＞0.05）；自主活動明顯減少（P＜0.05）；游泳時間明顯降低（P＜0.01），綜合評價說明腎陽虛造模成功；腎陽虛模型組的腹腔水液測量體積整體表現(xiàn)出下降的趨勢，腹水指數(shù)顯著高于正常組（P＜0.05）。結(jié)論該檢測方法可以快速、準確的測量出小鼠腹腔水液測量體積和腹水指數(shù)的變化，可以能較客觀地評價中醫(yī)證候的特點，為中醫(yī)證候癥狀描述進一步提供實驗數(shù)據(jù)支持。

證候模型；小鼠；腹腔水液體積檢測方法；阿基米德原理

在正常情況下，為了使各個臟器及腸道保持潤滑，機體的腹腔內(nèi)常會有少量的液體［1］，傳統(tǒng)中醫(yī)認為，水液在體內(nèi)主要是通過肺、脾、腎和三焦來共同完成吸收、轉(zhuǎn)輸和代謝，若臟腑功能紊亂，就會導(dǎo)致氣血津液運行失常，引起體內(nèi)水鈉儲留，形成腹水［2］。本研究采用腹腔注射苯甲酸雌二醇注射建立腎陽虛模型［3］，并在同一時間給予相同劑量的生理鹽水造成水負荷，連續(xù)15d，造成臟腑功能失調(diào)，使小鼠的水液代謝異常，腹水增多。查閱相關(guān)文獻［4］發(fā)現(xiàn)腹水的測量方法主要有稱體重、抽腹水測量腹水量、測量腹圍等，但以上方法干擾因素多，測量誤差大，極大地影響了對中醫(yī)證候模型整體的評價。因此，為了快速、準確、客觀地測量小鼠的腹腔內(nèi)的水液體積，我們基于“阿基米德原理”并改進實驗方法，創(chuàng)建了小鼠腹腔水液體積的檢測方法，并根據(jù)此方法評價腎陽虛模型小鼠的水負荷狀況。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級昆明種雄性小鼠，體重18g～22g，由山東魯抗動物實驗中心提供（許可證編號SCXK（魯）20080002）。

1.1.2 實驗試劑與儀器：0.9％氯化鈉注射液（山東潔晶藥業(yè)有限公司，批號11071272）；苯甲酸雌二醇（上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號100801）；蒸餾水；ZIL-2型小鼠自主活動儀（北京醫(yī)科院藥研所）；MC-142L歐姆龍電子體溫計（歐姆龍大連有限公司）；DT-880B手持式紅外人體表面溫度快速篩檢儀（深圳市華盛昌機械實業(yè)有限公司）；YP601N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；1000mL量杯，鐵架臺，天平砝碼（上海實干實業(yè)有限公司）；手術(shù)線；鑷子。

1.1.3 實驗條件：室溫控制在20℃～25℃，相對濕度55％～70％，保持室內(nèi)干燥、清潔，所有動物正常飲食飲水。

1.2 實驗方法

1.2.1 腹腔水液體積測量方法：（1）將量杯中裝入1 000mL的蒸餾水放在電子天平上讀數(shù)歸零，小鼠脫頸椎處死后仰臥取其胸骨劍突的位置（用細的記號筆標記）作為腹腔水液體積的測量點；（2）為了減少小鼠的浮力，用手術(shù)縫合線在小鼠的尾部負重20g的天平砝碼（最后測量結(jié)果應(yīng)減去20g砝碼所產(chǎn)生的體積）。注意測量過程中切勿碰到量杯的壁及底部，否則影響測量結(jié)果的準確性。根據(jù)“阿基米德原理”F浮=G排=ρ液gV排，物體排開液體的重力與液體的密度和被物體排開液體的體積兩個因素相關(guān)［5］，在該實驗中所用的液體是20℃的蒸餾水其密度為1.0g/cm3，因此物體排開液體的重力即為被物體排開液體的體積。（3）最后將小鼠緩慢的浸入量杯至測量點后固定在鐵架臺上，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀取數(shù)據(jù)即可。如圖1所示。

圖1 腹腔水液體積測量簡易圖Fig.1 Schematic diagram of the peritoneal fluid volume measurement

1.2.2 腹腔水液體積測量穩(wěn)定性實驗：選取12只正常小鼠，稱重，依據(jù)上述的方法測量。將小鼠從量杯取出后用濾紙將其身上的水分充分吸干再準確吸取1mL的蒸餾水注入小鼠的腹腔內(nèi)，重復(fù)上述操作讀取數(shù)據(jù)，然后比較注射1mL蒸餾水前后腹腔水液體積的差值，結(jié)果見表1。

1.2.3 腹腔水液體積測量線性關(guān)系考察：選取5只正常小鼠，稱重，脫頸椎處死后，分別準確吸取0mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL不同體積的蒸餾水注入小鼠的腹腔內(nèi)，按照5.1的實驗操作測量腹腔水液體積并計算腹水指數(shù)，考察其線性關(guān)系，結(jié)果見圖2。

1.2.4 腎陽虛模型小鼠腹腔水液體積的測量：將SPF級昆明種雄性小鼠30只，稱重，隨機分為正常組和腎陽虛模型組，腎陽虛模型組上午按0.08mg/10g腹腔注射苯甲酸雌二醇注射，每日的給藥劑量按照造模第一天小鼠的體重計算，連續(xù)15d，造成腎陽虛小鼠模型［6］，正常組上午腹腔注射相應(yīng)劑量的大豆油，下午兩組均給予1mL的生理鹽水造成水負荷，每日觀察小鼠的一般體征，在造模第13d測量兩組小鼠的肛溫、趾溫，第14天測量兩組小鼠的自主活動和游泳時間，綜合評價造模是否成功，造模成功后第15天，稱重，摘眼球取血，將量杯中裝入1 000mL的蒸餾水放在電子天平上將讀數(shù)歸零，然后重復(fù)5.1的實驗操作，比較正常組和腎陽虛模型組腹腔水液體積、腹水指數(shù)的差異。腹腔水液體積應(yīng)等于電子天平所顯示的讀數(shù)，腹水指數(shù)=腹腔水液體積/體重×100％。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本均數(shù)比較的t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹腔水液體積穩(wěn)定性評價

實驗結(jié)果表明該測量方法對于測量小鼠的腹腔水液體積具有良好的穩(wěn)定性，見表1。

表1 12只小鼠注射1mL蒸餾水前后腹腔水液體積比較（±s）Tab.1 Comparison of the peritoneal fluid volume in 12 mice after intraperitoneal injection of 1mL distilled water（±s）

表1 12只小鼠注射1mL蒸餾水前后腹腔水液體積比較（±s）Tab.1 Comparison of the peritoneal fluid volume in 12 mice after intraperitoneal injection of 1mL distilled water（±s）

測量時間Measurement time動物只數(shù)（n） Number of mice腹腔水液體積（mL） Peritoneal fluid volume注射前Before injection 12 33.57±1.73注射后 After injection 12 34.58±1.67差值Diffence 1.01±0.29

2.2 線性關(guān)系考察

按照5.1的實驗方法測定腹腔水液體積，以向小鼠腹腔內(nèi)注射蒸餾水的劑量為橫坐標，分別以腹腔水液體積、腹水指數(shù)為縱坐標做回歸分析，得回歸方程分別為Y=0.952 9X-0.052 1（R2=0.9947），Y=8.941 6X+106.62（R2=0.926 9），結(jié)果表明，注射蒸餾水的量在0～3mL之間與腹腔水液體積、腹水指數(shù)之間呈良好的線性關(guān)系，見圖2、圖3。

圖2 注射蒸餾水的量與腹腔水液體積線性關(guān)系考察Fig.2 Linear relationship of the injected distilled water and peritoneal fluid volume

圖3 注射蒸餾水的量與腹水指數(shù)線性關(guān)系考察Fig.3 The linear relationship of injected distilled water and ascites index

表2 兩組小鼠造模前后體重的變化Tab.2 Comparison of the body weight of the model mice of the two groups before and after modeling

表3 兩組小鼠肛溫、趾溫、自主活動、游泳時間的比較Tab.3 Comparison of two groups of the rectal temperature，toe temperature，locomotor activity and swimming time of mice in the two groups

表4 兩組小鼠腹腔水液體積、腹水指數(shù)比較（±s）Tab.4 Comparison of peritoneal fluid volume and ascites indexes of the mice in the two groups（±s）

表4 兩組小鼠腹腔水液體積、腹水指數(shù)比較（±s）Tab.4 Comparison of peritoneal fluid volume and ascites indexes of the mice in the two groups（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05。Note：Compared with the normal group，*P＜0.05.

組別Groups動物數(shù)（n） Number of mice腹腔水液測量體積Peritoneal fluid volume腹水指數(shù)（％） Ascites index正常組Normal 15 20.39±1.91 61.76±3.57腎陽虛模型組Kidney yang-deficiency 13 17.22±2.10 65.09±3.77*

2.3 正常組與腎陽虛模型組小鼠一般體征的比較

正常組小鼠皮毛干爽、對外界反應(yīng)靈敏，精神狀態(tài)好，體重呈逐漸增長的趨勢，腎陽虛模型組小鼠皮毛無光澤，出現(xiàn)豎毛現(xiàn)象，背腹部潮濕出汗，蜷縮，精神萎靡，對外界反應(yīng)遲鈍，體重降低等腎陽虛表現(xiàn)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，與正常組相比，造模后體重顯著性降低（P＜0.01），見表2。

2.4 正常組與腎陽虛模型組小鼠肛溫、趾溫、自主活動、游泳時間的比較

與正常組相比，造模后肛溫顯著性降低（P＜0.01），趾溫差異無顯著性（P＞0.05）；自主活動明顯減少（P＜0.05）；游泳時間明顯降低（P＜0.01），綜合評價體重、肛溫、趾溫、自主活動、游泳時間，說明腎陽虛造模成功，見表3。

2.5 正常組與腎陽虛模型組腹腔水液體積、腹水指數(shù)比較

與正常組相比，腎陽虛模型組腹腔水液體積整體表現(xiàn)出下降的趨勢，腹水指數(shù)模型組高于正常組，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

3 討論

水腫是過多液體在組織間隙或體腔中積聚的一種病理過程，水腫液在體腔內(nèi)蓄積過多時通常稱為積液或積水，如胸腔積水（胸水），腹腔積水（腹水）、心包積水、腦室積水等，腹水屬于中醫(yī)學(xué)“鼓脹”范疇，是臨床常見病證之一。產(chǎn)生腹水的病因很多，比較常見的是肝性腹水、癌性腹水、結(jié)核性腹水等，是腹腔內(nèi)液體的產(chǎn)生和吸收失去動態(tài)平衡的結(jié)果。中醫(yī)認為，水為陰邪，水液停聚，運化失常，或為痰、或為飲，聚集在體內(nèi)既是病理產(chǎn)物，又是常見的致病因素。腹水的產(chǎn)生可由脾失健運、運化失職、水濕停滯、腎失氣化所致，長期腹水積聚可使脾肺腎的功能失調(diào)導(dǎo)致水濕內(nèi)停［7］。臨床上對陽虛型腹水患者可通過望聞問切來辯證處方［8］，但基礎(chǔ)研究卻缺乏對實驗動物腹水情況進行客觀、精確的測量方法。本研究采用苯甲酸雌二醇注射液造成腎陽虛模型，模型小鼠出現(xiàn)豎毛、弓背蜷縮、背腹部出汗、消瘦、畏寒肢冷、精神萎靡、腰膝酸軟等腎陽虛證狀。與正常組相比，腎陽虛模型組的肛溫顯著性降低（P＜0.01），說明畏寒肢冷造模成功；自主活動明顯減少（P＜0.05），說明精神萎靡造模成功；游泳時間明顯降低（P＜0.01），說明腰膝酸軟造模成功。腎陽虛常會導(dǎo)致水泛，水液代謝失常，本實驗對腎陽虛小鼠腹腔注射過量的生理鹽水，連續(xù)15d，將會導(dǎo)致模型動物機體內(nèi)因腎陽虛衰，氣化無權(quán)，水濕潴留，伴有不同程度腹腔積水的“水濕內(nèi)?！钡谋憩F(xiàn)，這也同時符合了中醫(yī)“腎陽不足，肺失通調(diào)，脾失健運，腎失開闔”在病機方面的演變規(guī)律［9］。因此，我們通過檢測腎陽虛模型小鼠腹腔水液測量體積和腹水指數(shù)的變化可以能較客觀地評價中醫(yī)證候的特點，為中醫(yī)證候癥狀描述進一步提供實驗數(shù)據(jù)支持。

阿基米德原理是浸在液體里的物體受到向上的浮力，浮力的大小等于物體排開液體所受的重力，F(xiàn)浮=G排=ρ液gV排，物體排開液體的重力是由液體的密度和被物體排開的液體的體積，浮力的大小與被測物體的密度、質(zhì)量、體積、形狀等無關(guān)，同時也與容器中液體的多少沒有關(guān)系。在該實驗中所用20℃蒸餾水的密度為1.0g/cm3，因此我們利用G排=V排，物體排開液體的重力即為被物體排開液體的體積。本研究就是利用了“阿基米德原理”改進實驗方法對該方法進行了穩(wěn)定性實驗和線性關(guān)系考察均取得了良好的效果。小鼠胸骨劍突以下解剖部位主要包括胃、腸等腹腔臟器組織，因此為了能夠準確的測量小鼠腹腔水液測量體積的變化，我們選擇小鼠胸骨劍突部位作為測量點，該研究采用腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液建立腎陽虛模型，并在相同的時間點腹腔注射1mL的生理鹽水造成水負荷，連續(xù)造模15d，造成小鼠臟腑功能失調(diào)，水液代謝異常，腎陽虛模型小鼠因動物消瘦、體質(zhì)羸弱，其體重和腹腔水液測量體積在整體上表現(xiàn)出下降的趨勢（這也能排除因動物皮下脂肪、腸道內(nèi)容物等增多會造成腹腔水液測量體積的增高，而出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象），但腹水指數(shù)卻顯著性升高，與正常對照組比較差異有顯著性（P＜0.05），該測量方法簡單易行、容易操作，可以快速的測量出小鼠的腹水指數(shù)，為以腹水為指征的相關(guān)中醫(yī)證候模型的評價提供借鑒和參考，為中醫(yī)證候模型的客觀化評價提供量化的數(shù)據(jù)支持。

濟南益延科技發(fā)展有限公司李云峰老師對本實驗提出的寶貴意見，在此表示感謝!

［1］孫文江，石君華.真武湯治療陽虛型腎病綜合征水腫臨床觀察［J］.湖北中醫(yī)雜志，2009，31（6）：46-47.

［2］姜群生.經(jīng)方治療腎系水腫病的研究與分析［D］.北京，中國中醫(yī)科學(xué)院，2010.

［3］陳素紅，呂圭源，范景，等.海馬不同提取物對雌二醇致腎陽虛小鼠的影響［J］.中草藥，2009，40（2）：258-262.

［4］張萍，任永申，付強，等.軟肝消水巴布劑對S180腹水模型小鼠的治療作用［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2007，23（4）：259-262.

［5］宋維才，侯桂民.阿基米德原理的內(nèi)涵［J］.唐山師專學(xué)報，2000，22（2）：50-51.

［6］李靜，楊勇，尹翠翠，等.腎陽虛小鼠模型呼吸代謝轉(zhuǎn)換率、產(chǎn)熱量的實驗研究［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，37（2）：148-151.

［7］李霞.加味柴苓湯聯(lián)合順鉑、白介素-2腹腔內(nèi)注射治療肝癌腹水的臨床研究［D］.南京，南京中醫(yī)藥大學(xué).

［8］韓凱.中西醫(yī)結(jié)合治療脾腎陽虛型腹水療效觀察［J］.中醫(yī)學(xué)報，2012，27（10）：1369-1370.

［9］王鈺霞，陳魁敏，郝偉.真武湯對陽虛小鼠作用的實驗研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2001，7（1）：48-49.

Establishment of a measurement method of peritoneal fluid volume and evaluation of the water load in mouse models of kidney-yang deficiency syndrome

LI Jing，YANG Yong，RONG Rong
（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

ObjectiveTo establish a measurement method of peritoneal fluid volume in mice and evaluation of the water load in mouse models of kidney-yang deficiency syndrome in Chinese medicine.MethodsTo improve the measurement method of peritoneal fluid volume in mice based on Archimedes’principle.Twelve normal mice were selected to evaluate the measurement stability of peritoneal fluid volume.Five normal mice were selected for study of the linear relationship of ascites detection method.Thirty SPF male Kunming mice were randomly divided into control group and kidney-yang deficiency model group.The mouse models of kidney-yang deficiency were generated by intraperitoneal injection of estradiol benzoate in a dose of 0.08mg/10 g in the morning for consecutive 15 days.The mice of normal control group were injected the same dose of soybean oil.All mice of the both groups

intraperitoneal injection of 1mL saline in the afternoon to make water load.ResultsGood effect of the measurement stability and linear relationshipstudy was achieved.Compared with the control group，the body weight of mice after modeling was significantly decreased，rectal temperature significantly declined（P＜0.01），spontaneous motor activity was significantly reduced（P＜0.05），and swimming time was significantly shorter（P＜0.01）.All the signs indicated that the kidney-yang deficiency was successfully produced in the mice.The peritoneal fluid volume in mice of the kidney-yang deficiency model group showed a decreasing trend，and the ascites index was significantly higher than that of the control group（P＜0.05）.Conclusions The established detection method can quickly and accurately measure the mice peritoneal cavity fluid volume and changes of the ascites index.It can be used to objectively evaluate the characteristics of TCM syndrome and provide experimental data for the TCM symptom description.

Syndrome，Chinese medicine；Mouse，model；Mice；Peritoneal fluid volume；Detection method；Archimedes’principle

R33

A

1671-7856（2014）02-0074-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.016

國家自然科學(xué)基金項目（No.81273626）；山東省中醫(yī)藥科技項目（No.2011-027）；山東省高等學(xué)校科技計劃項目（No.J10LF20）。

李靜（1987-），女，碩士研究生，研究方向：經(jīng)方的現(xiàn)代研究，電話：0531-89628505，Email：jinging1206@163.com。

楊勇（1972-），男，副教授，研究方向：經(jīng)方的現(xiàn)代研究，電話：0531-89628505，Email：yy7204@163.com。

2013-12-11

綜述與專論