比格犬雌激素β受體RNA干擾實驗細胞及PCR檢測引物的篩選

鐘 睿，甘 藝，趙彥斌，劉 冰，孫兆增，朱宇旌，欒新紅，胡仲明，張 勇，曾 林

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，沈陽 110866；2.軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京 100071；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

比格犬雌激素β受體RNA干擾實驗細胞及PCR檢測引物的篩選

鐘 睿1，2，甘 藝3，2，趙彥斌2，劉 冰2，孫兆增2，朱宇旌1，欒新紅1，胡仲明2，張 勇1，曾 林2

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，沈陽 110866；2.軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京 100071；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

目的篩選用于比格犬ERβ基因RNA干擾實驗的細胞和檢測所用引物。方法根據(jù)比格犬ERβ氨基末端區(qū)域和DNA結(jié)合區(qū)設(shè)計三對引物，用陽性質(zhì)粒篩選最佳引物應用于RNA干擾效果檢測，并利用293T、Hela和vero細胞的cDNA驗證該引物的特異性。對這三種細胞內(nèi)人ERβ基因的存在情況也進行了檢測。結(jié)果經(jīng)過三次重復性實驗之后，結(jié)果顯示引物C36684擴增效率高，且沒有非特異條帶，該引物對293T、Hela和vero細胞cDNA擴增時同樣沒有非特異性條帶，但293T細胞中存在人的ERβ基因。結(jié)論引物C36684用于檢測RNA干擾效率，而Hela細胞則作為RNA干擾實驗的細胞工具。

ERβ基因；比格犬；篩選引物；細胞

比格犬廣泛的應用于各種醫(yī)學科研，是國內(nèi)外公認的實驗犬［1］。近幾年，對比格犬生殖調(diào)控機理和技術(shù)的研究已成為國內(nèi)外的熱點研究問題之一［2］。近來發(fā)現(xiàn)比格犬種群中存在不發(fā)情或者發(fā)情不孕這樣的情況，影響著比格犬的生產(chǎn)［3］。對于發(fā)情這一生理現(xiàn)象，主要受下丘腦-垂體-性腺軸來調(diào)控，其在雌激素的調(diào)節(jié)上也起著重要的作用，ERβ是目前普遍存在于動物體內(nèi)的參與生殖調(diào)控的基因，不過對于ERβ是如何參與調(diào)控過程的還不是很清楚，在生殖過程中各種參與調(diào)控的基因之間的關(guān)系研究的也不是很透徹，ERβ較另一種調(diào)控生殖的基因ERα的發(fā)現(xiàn)晚了一段時間，不過有資料顯示ERα和ERβ這兩種雌激素受體序列同源性很高，對E2也有著相似的親和性并結(jié)合著相同的DNA反應元件［4］，二者的主要差異在氨基末端區(qū)域，因此本實驗主要針對ERβ的氨基末端設(shè)計引物。

本課題組前期已經(jīng)通過克隆獲得比格犬ERβ基因，也構(gòu)建了重組真核質(zhì)粒pEGFP-N1-ERβ，但是還要繼續(xù)深入的研究ERβ基因的功能，需通過更為先進的實驗技術(shù)來探究，RNA干擾技術(shù)就是一項目前應用較為普遍的探究基因功能的技術(shù)之一，因此本課題組擬通過應用RNA干擾技術(shù)來深入探究ERβ基因的功能，但是應用RNA干擾技術(shù)，就要檢測干擾效率，還要應用細胞在體外篩選出干擾效果最佳的干擾序列，進而對比格犬進行基因沉默實驗，從而探究ERβ基因的功能，如果細胞中存在ERβ基因，無疑會干擾實驗結(jié)果，而且還要從轉(zhuǎn)染效率，細胞活率等因素綜合考慮應用于RNA干擾實驗中的細胞，為解決這些問題，本實驗需篩選出應用于檢測RNA干擾效率的PCR引物，再篩選出應用于RNA干擾實驗的最佳細胞。

1 材料和方法

1.1 材料

ERβ基因來源于本課題組前期實驗人員構(gòu)建的pEGFP-N1-ERβ重組質(zhì)粒。293T、hela和vero細胞為本室凍存細胞。DMEM（Dulbecco's modified Eagle's）培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶購自Hyclone公司［5］。LA Taq、dNTP購自TaKaRa公司。TRIZOL購自Invitrogen公司。DEPC購自Promega公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace購自TOYOBO公司。氯仿、異丙醇等試劑為國產(chǎn)分析純試劑，均購自軍事醫(yī)學科學院條件處。

1.2 方法

1.2.1 比格犬ERβ基因引物設(shè)計：第一對引物上游C36684：5'-tattccgccgtgaccttctat-3'，下游C36685：5'-cagctcttgcgtcgattcttat-3'，擴增片段長度為476bp；第二對引物上游C36686：5'-aatattccgccgtgaccttcta-3'，下游C36687：5'-ggccttacatccttcacacgac-3'，擴增片段長度為389bp；第三對引物上游C36688：5'-ccttagccatccattgccagtc-3'，下游同第一對引物，擴增片段長度為340bp。引物送至博邁德生物有限公司合成。

1.2.2 比格犬ERβ基因引物有效性檢測：采用梯度PCR法用1.2.1中設(shè)計的三對引物擴增pEGFPN1-ERβ，梯度PCR每孔對應的退火溫度為52.0℃、52.2℃、52.5℃、53.0℃、53.7℃、54.6℃、55.6℃、56.5℃、57.1℃、57.6℃、57.9℃、58.0℃，PCR反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s；梯度52℃～58℃退火30s；72℃延伸2min；經(jīng)過33個循環(huán)之后，72℃延伸8min；4℃ forever，根據(jù)擴增結(jié)果選出最佳引物以及最佳退火溫度。

1.2.3 比格犬ERβ基因引物特異性檢測：采用Trizol一步法提取三種細胞的RNA后反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄步驟如下：65℃變性5min，置于冰上；42℃ 60min，99℃5min，4℃5min。得到的cDNA進一步進行PCR反應，反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s；56.5℃退火30s；72℃延伸2min；經(jīng)過33個循環(huán)之后，72℃延伸8min；4℃forever，反應結(jié)束后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 檢測細胞內(nèi)人ERβ基因的存在情況：人ERβ基因引物上游C42846：5'-cacctgggcacctttctccttt ag-3'，下游C42847：5'-gcagcagctcccgcactcg-3'，如

1.2.3中獲得細胞cDNA后進行PCR反應，反應程序亦同1.2.3，反應結(jié)束后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 引物有效性檢測結(jié)果

用三對引物對pEGFP-N1-ERβ質(zhì)粒進行三次重復性擴增之后，結(jié)果均顯示引物C36684擴增效果最佳，現(xiàn)就其中一組實驗結(jié)果做分析。如圖1A所示，條帶均清晰，但在2 000bp之上有不是很明顯的非特異性擴增帶，第5條帶非特異帶最不明顯，效果最好。圖1B條帶較清晰，但在250bp和750bp處有非特異性擴增條帶。圖1C條帶模糊。因此選用C36684作為PCR檢測RNA干擾效果的最佳引物，最佳溫度選為56.5℃。

2.2 引物特異性檢測結(jié)果

得到三種細胞cDNA后，亦用引物C36684經(jīng)過三次反復擴增，結(jié)果顯示三種細胞內(nèi)沒有ERβ基因。選出其中一組結(jié)果，即圖2所示結(jié)果，三種細胞中均未擴增出比格犬ERβ基因，說明C36684具有良好的特異性。

2.3 檢測細胞內(nèi)人ERβ基因的存在情況結(jié)果

人ERβ基因與犬ERβ基因享有著高度同源性，如果細胞內(nèi)存在人ERβ基因，仍會影響實驗結(jié)果，因此用引物C42846擴增三種細胞cDNA，同樣經(jīng)過三次重復性試驗后，選出其中一組實驗結(jié)果，即如圖3所示，293T細胞內(nèi)存在人ERβ基因，hela和vero內(nèi)不存在人ERβ基因，也就說293T細胞內(nèi)存在ERβ基因的干擾，不能選用其作為細胞工具。

M：DL2000 DNA分子量標準；A：C36684擴增結(jié)果；B：C36686擴增結(jié)果；C：C36688擴增結(jié)果；陰性對照：擴增模板為ddH2O。圖1 三對引物擴增pEGFP-N1-ERβ質(zhì)粒鑒定結(jié)果M：DL2000 DNA molecular standard；A：Result of amplification by C36684；B：Result of amplification by C36686；C：Result of amplification by C36688；Negative control：The template.Fig.1 Identification of pEGFP-N1-ERβ plasmids amplified by the three primers

M：DL2000 DNA分子量標準；1、9、17：陽性對照，擴增模板為pEGFP-N1-ERβ；2、10、18：陰性對照，擴增模板為ddH2O；3～8：擴增模板為293T細胞六組樣品；11～16：擴增模板為hela細胞六組樣品；19～24：擴增模板為vero細胞六組樣品。圖2 三種細胞cDNA擴增結(jié)果M：DL2000 DNA molecular standard；1，9，17：Positive control，the template was pEGFP-N1-ERβ；2，10，18：Negative control，the template was ddH2O；3-8：The templates were six samples from 293T cells；11-16：The templates were six samples from Hela cells；19-24：The templates were six samples from Vero cells.Fig.2 The results of amplification of cDNA from the three cell lines

M：DL2000 DNA分子量標準；1～6：擴增模板為hela細胞六組樣品；7、16、25：C36684引物擴增pEGFP-N1-ERβ；8、17、26：C42846引物擴增pEGFP-N1-ERβ；9、18、27：陰性對照；10～15：擴增模板為293T細胞六組樣品；19～24：擴增模板為vero細胞六組樣品。圖3 hERβ引物擴增三種細胞cDNA結(jié)果M：DL2000 DNA molecular standard；1-6：The templates were six samples from Hela cells；7，16，25：Amplified pEGFP-N1-ERβ by C36684 primers；8，17，26：Amplified pEGFP-N1-ERβ by C42846 primers；9，18，27：Negative control；10-15：The templates were six samples from 293T cells；19-24：The templates were six samples from Vero cells.Fig.3 Results of cDNA amplification from the three cell lines by hERβ primers

3 討論

前言已經(jīng)提到ERα和ERβ僅在氨基末端區(qū)域有主要差異，因此需要針對氨基末端設(shè)計引物以顯示ERβ的特異性。ERβ的氨基末端為12～124aa，共編碼339bp，這339bp經(jīng)DNA STAR軟件分析后沒有特異性的引物序列，理論與實際發(fā)生了碰撞，因此，又把設(shè)計區(qū)域擴大到DNA結(jié)合區(qū)，ERβ的DNA結(jié)合區(qū)為144～225aa，共編碼246bp。把編碼ERβ氨基末端與DNA結(jié)合區(qū)序列經(jīng)DNA STAR軟件分析后得出該實驗中的三對特異性引物序列。

本實驗所涉及的三種細胞，293T細胞為293細胞派生，為人腎上皮細胞系，Hela細胞源自一位美國婦女海莉耶塔·拉克斯子宮頸癌細胞的細胞系，而Vero細胞為非洲綠猴腎細胞。在NCBI上獲取人（Gene ID：34193698）和猴（Gene ID：402766370）的ERβ基因，檢索結(jié)果顯示NCBI上沒有非洲綠猴的ERβ基因序列，所查猴源ERβ序列為恒河猴的ERβ序列。經(jīng)DNA STAR軟件分析后，人與犬ERβ序列同源性為87.3％，這可以從本實驗圖3中用人ERβ基因的引物擴增出犬ERβ基因所證實，犬與猴的序列同源性為87.8％，人與猴的序列同源性為95.3％，分析結(jié)果顯示人、犬、猴的ERβ序列同源性很高，但本實驗并沒有從293T、Hela和Vero細胞中擴增出比格犬ERβ基因，恰好證明了引物特異性強，不過也可能由于擴增的特定序列差異顯著，還有可能是ERβ不影響腎的結(jié)構(gòu)和功能，有資料顯示，ERβ基因在免疫、骨骼、心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面有著不同的非冗余的作用［6］，還有資料顯示，雌激素是一種形態(tài)發(fā)生素，其在形態(tài)發(fā)生上的作用是在ERβ基因敲除鼠的子宮［7］、卵巢［7］、乳腺［7］、前列腺［8］、肺［9］和腦［10］的結(jié)構(gòu)上所證實的。但本實驗并沒有從Hela細胞內(nèi)擴增出ERβ基因，不知道怎樣解釋這一科學現(xiàn)象，可是本實驗卻證實293T細胞內(nèi)有ERβ基因，這又怎么解釋呢?在2001年對于小鼠大腦ERβ的研究表明ERβ對神經(jīng)元復蘇的影響作用追溯到胚胎期的第15天。對于子宮、陰道、前列腺及肺而言，在胚胎期的第9～16天是雌激素使雄性化的影響的第一個關(guān)鍵階段。第二個關(guān)鍵階段為產(chǎn)后的1～6d，這一階段是前列腺及骨骼形成階段［4］，雖然沒有直接說明為什么293T細胞內(nèi)會有ERβ基因，不過從側(cè)面證實ERβ基因在胚胎時期起作用，因此293T細胞內(nèi)有ERβ基因也不足為奇。既然293T細胞內(nèi)存在ERβ基因，而人與犬ERβ基因同源性有很高，所以293T細胞不能用在后續(xù)RNA干擾實驗中。那么就從Hela細胞和Vero細胞中擇一。由于Hela細胞可以無限分裂并且轉(zhuǎn)染效率高，因此本實驗選用Hela細胞作為后續(xù)RNA干擾實驗的細胞工具。

［1］孫兆增，曾林，洪寶慶，等.乙烯雌酚對間情期比格犬發(fā)情的誘導［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2008，18（11）：36-38.

［2］任秀梅，趙彥斌，胡仲明，等.比格犬一種新雌激素β受體可變剪切體的克隆及鑒定［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2012，22（7）：36-39.

［3］許琴，趙彥斌，胡仲明，等.間情期與發(fā)情期比格犬子宮與卵巢組織形態(tài)學的比較［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2012，22（7）：44-47.

［4］Heldring N，Pike A，Andersson S，et al.Estrogen receptors：how do they signal and what are their targets［J］.Physiol Rev，2007，87：905-931.

［5］曹玉華，嚴翔，劉一，等.棕頭蜘蛛猴Atfu-B基因α2結(jié)構(gòu)域缺失剪切異構(gòu)體的表達及其細胞內(nèi)定位［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2013，23（10）：63-66.

［6］Harris H.Estrogen receptor-beta：recent lessons from in vivo studies［J］.Mol Endocrinol，2007，21（1）：1-13.

［7］F?rster C，M?kela S，W?rri A，et al.Involvement of estrogen receptor β in terminal differentiation of mammary gland epithelium［J］.Proc Nat Acad Sci U S A，2002，99（24）：15578-15583.

［8］Weihua Z，Malela S，Andersson LC，et al.A Role for estrogen receptor beta in the regulation of growth of the ventral prostate［J］.Proc Nati Acad Sci U S A，2001，98（11）：6330-6335.

［9］Morani ABR，Imamov O，Hultenby K，et al.Lung dysfunction causes systemic hypoxia in estrogen-receptor beta knockout mice［J］.Proc Nati Acad Sci U S A，2006，103（18）：7165-7169.

［10］Wang L，Andersson S，Warner M，et al.Morphological abnormalities in the brains of estrogen receptor beta knockout mice［J］.Proc Nati Acad Sci U S A，2001，98（5）：2792-2796.

PCR primers and cell screening for the RNA interference of estrogen receptor beta in Beagles

ZHONG Rui1，2，GAN Yi3，2，ZHAO Yan-bin2，LIU Bing2，SUN Zhao-zeng2，ZHU Yu-jing1，LUAN Xin-hong1，HU Zhong-ming2，ZHANG Yong1，ZENG Lin2
（1.College of Veterinary and Animal Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；2.Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071；3.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

ObjectiveTo screen the cells and construct primers to be used for RNA interference experiment of ERβ gene in Beagles.MethodsThree pairs of primers were designed according to the amino terminal and DNA binding area of ERβ gene in Beagles，and the best primers were screened as the primers to be used to detect RNA interference effect by positive plasmid，and the cDNA from 293T，Hela and Vero cells was used to validate the specificity of the primers.The existence of homo ERβ gene was also tested in the three cell types.ResultsAfter experiments repeated for three times，the results showed that they had high amplification effect and there was no nonspecific amplification by the C36684 primers.The amplification results of cDNA from 293T，Hela and Vero cells also showed that there was no nonspecific amplification by the primers，but there was homo ERβ gene expression in 293T cells.Conclusion The C36684 primer pair is selectedfor detecting RNA interference effect，and Hela cells are selected as the tool for RNA interference experiment.

ERβ gene；Beagles；Screening primers；Cells

R33

A

1671-7856（2014）02-0042-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.010

國家自然科學基金資助項目31172164。

鐘睿（1987-）女，碩士生，動物營養(yǎng)與飼料科學專業(yè)。

曾林（1965-），男，博士生導師，實驗動物科學與管理；張勇（1972-），男，碩士生導師，分子營養(yǎng)學、飼料生物技術(shù)。

2013-11-25