PSGL-1基因敲除小鼠血中MIP-1γ和TNF-α的表達(dá)

李江超，周澤啟，葉 杰，韓 露，葉宇翔，劉 影，何曉東，陳 卉，袁俏冰，黎 帥，張靜麗，王麗京

（廣東藥學(xué)院 血管生物學(xué)研究所，廣東 廣州 510006）

PSGL-1基因敲除小鼠血中MIP-1γ和TNF-α的表達(dá)

李江超，周澤啟，葉 杰，韓 露，葉宇翔，劉 影，何曉東，陳 卉，袁俏冰，黎 帥，張靜麗，王麗京

（廣東藥學(xué)院 血管生物學(xué)研究所，廣東 廣州 510006）

目的研究PSGL-1缺失對遺傳基因工程小鼠外周血血常規(guī)的影響，并檢測外周血中炎癥因子IGFBP-6、TNF-α和MIP-1γmRNA表達(dá)水平。方法用血常規(guī)檢測方法檢測正常C57/BL/6小鼠和PSGL-1基因缺失的基因工程小鼠（PSGL-1-/-小鼠）的外周血中血常規(guī)的差異；其次，提取兩種鼠的血液的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用real-time PCR方法，檢測C57小鼠與PSGL-1-/-小鼠外周血中炎癥因子TNF-α和MIP-1γmRNA的差異。結(jié)果與對照組C57小鼠相比，PSGL-1-/-基因工程小鼠在12周齡時(shí)外周血中中性粒細(xì)胞（*P＜0.05）、淋巴細(xì)胞（＊＊P＜0.01）和白細(xì)胞細(xì)胞（＊＊＊P＜0.001）總數(shù)顯著增加炎癥因子TNF-α以及MIP-1γ表達(dá)增加（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)SGL-1的缺失改變了小鼠細(xì)胞因子并影響了外周血的血細(xì)胞組成，MIP-1γ和TNF-α炎癥因子上調(diào)，有可能影響了小鼠的免疫功能。

PSGL-1；TNF-α；MIP-1γ，基因工程動物

P-選凝素糖蛋白配體1（P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1）是20世紀(jì)90年代初期發(fā)現(xiàn)的一種黏附分子，具有同源二聚體結(jié)構(gòu)的跨膜糖蛋白，表達(dá)于白細(xì)胞的膜表面。PSGL-1是P-選凝素的配體，同時(shí)也是L-選凝素和E-選凝素的配體，研究表明其在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在炎癥環(huán)境中，PSGL-1與P-選凝素的相互作用在白細(xì)胞黏附的起始階段發(fā)揮重要作用，促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接和穿越血管壁到炎癥部位［1］。PSGL-1在介導(dǎo)白細(xì)胞黏附的同時(shí)，也可以作為信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外信號，促進(jìn)白細(xì)胞活化并使其穩(wěn)定黏附［2］。另外研究表明PSGL-1對T細(xì)胞歸巢有著顯著影響，從而影響T細(xì)胞的發(fā)育［3］。而最近的報(bào)道，PSGL-1表達(dá)在轉(zhuǎn)移的前列腺癌細(xì)胞上，所以其分子機(jī)制和功能有待進(jìn)一步研究［4］。

遺傳基因工程小鼠模型是生命科學(xué)研究手段中具人類疾病模擬性的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，小鼠是哺乳類?shí)驗(yàn)動物，具有體型小，繁殖力強(qiáng)，飼養(yǎng)成本低，能較好模擬人體等多種優(yōu)點(diǎn)，所以我們采用PSGL-1敲除的基因工程小鼠，在動物水平驗(yàn)證了PSGL-1對免疫功能得影響，比細(xì)胞水平有著顯著優(yōu)勢。因?yàn)榧?xì)胞水平無法模擬免疫學(xué)的改變。利用基因工程小鼠建立各種腫瘤模型是當(dāng)今腫瘤學(xué)研究的新趨勢?；蚯贸∈竽Ｐ驮谀[瘤學(xué)研究上具有其它模型無法比擬的優(yōu)勢：在不伴有藥物副作用的條件下，基因產(chǎn)物的作用被完全消除［5-6］。

在本研究中，為了進(jìn)一步了解PSGL-1的作用和功能，我們采用PSGL-1基因工程敲除小鼠，進(jìn)一步在動物體內(nèi)了解PSGL-1缺失后對免疫細(xì)胞和炎癥因子的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PSGL-1敲除后，小鼠的血常規(guī)發(fā)生改變，重要的炎癥因子TNF-α和趨化因子MIP-1γ顯著上升。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究PSGL-1如何在機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)炎癥從而發(fā)揮作用有著重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

PSGL-1-/-小鼠（B6.Cg-Selplgtm1Fur/J）購買自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室，SPF環(huán)境中飼養(yǎng)擴(kuò)群。蛋白酶K及dNTP等PCR體系為Sigma公司產(chǎn)品，Trizol購自Invitrogen，PCR引物由Invitrogen公司合成，Taq酶、Tris飽和酚及氯仿、異丙醇為廣州康龍公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 建系及擴(kuò)群：PSGL-1+/-與同籠PSGL-1+/-小鼠雜交，得到的子代有三種情況PSGL-1+/-、PSGL-1+/+、PSGL-1-/-，經(jīng)鑒定后得到PSGL-1-/-即目的實(shí)驗(yàn)的小鼠，PSGL-1+/+即為正常小鼠（C57小鼠），作為對照，PSGL-1+/-用來繁殖和配種。

1.2.2 PSGL-1-/-基因工程小鼠鑒定：PSGL-1-/-小鼠鑒定引物序列為：野生型：P1：5'-AGC TTC CTT GTG CTG CTG AC-3'：P2：5'-TCA AAA TCG TCA TCC CCA AC-3'，擴(kuò)增條帶為140bp；PSGL-1基因突變型：P1：5'-TCA AAA TCG TCA TCC CCA AC-3'：P2：5-'CCT TCT ATC GCC TTC TTG ACG-3'，擴(kuò)增條帶為500bp。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃/30s、65℃/1min、72℃/1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min。用1％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.3 外周血血常規(guī)的檢測：取同批周齡大小的C57、PSGL-1-/-小鼠（11周，雌雄比例均衡），每組4只，眼眶取血，檢測外周血中變化情況，采用臨床血常規(guī)儀器計(jì)數(shù)各類細(xì)胞的百分比和絕對值。

1.2.4 熒光定量PCR：對上述分組小鼠，眼眶取血法取C57、PSGL-1-/-，500μL血中加入1mL Trizol，12 000r/min，4℃離心10min；吸取上清液至一新的EP管中，靜置5min，使之充分裂解；加入200μL氯仿，劇烈震蕩15s，然后放置3min；13 400r/min，4℃離心15min，離完后分為3層，取最上層（中間一層為蛋白）至一新的EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒數(shù)次，室溫沉淀10min；13 400r/min，4℃離心10min，棄上清液；加入75％乙醇（DEPC水溶解），顛倒數(shù)次混勻；8 300r/min，4℃5min，棄上清液，小心吸盡液體（此時(shí)可以看到白色沉淀即為RNA）；RNA略干后加入20μL DEPC水。用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用得到cDNA進(jìn)行real-time PCR，（Tiangen kit貨號FP205）95℃預(yù)變性15min，94℃/10min、60℃/32s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，融解曲線分析引物特異性，Ct值標(biāo)準(zhǔn)化后計(jì)算相對拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PSGL-1基因繁殖和鑒定

根據(jù)PCR后電泳條帶結(jié)果，可以區(qū)分出條帶為500bp的為PSGL-1基因突變的小鼠，即PSGL-1-/-小鼠，如圖1第二泳道（從左向右）即是；PCR擴(kuò)增條帶為500bp和140bp為雜合子PSGL-1+/-，圖1中第一泳道即是，野生型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶為140bp。其中長度約500 bp的條帶為PSGL-1基因突變的小鼠特有的條帶；140bp的條帶為正常小鼠以及PSGL-1基因突變的雜合小鼠都應(yīng)該具有的條帶。

注：Marker：DNA marker 2000。圖1 鑒別PSGL-1缺失的基因小鼠Note：Marker：DNA marker 2000.Fig.1 Identification of the PSGL-1-/-mice

2.2 PSGL-1基因工程小鼠中外周血常規(guī)異常

取C57小鼠和PSGL-1-/-小鼠的外周血進(jìn)行血常規(guī)檢驗(yàn)，與正常小鼠對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSGL-1-/-外周血中中性粒細(xì)胞（P＜0.05）、淋巴細(xì)胞（P＜0.01）和白細(xì)胞細(xì)胞總數(shù)顯著增加（P＜0.001）（圖2），在本實(shí)驗(yàn)中BASO為噬堿細(xì)胞絕對值、EO為噬酸細(xì)胞絕對值、LYMPH為淋巴細(xì)胞絕對值、MONO為單核細(xì)胞絕對值、NEUT為分葉細(xì)胞（中性粒細(xì)胞）絕對值、WBC為白細(xì)胞絕對值。嗜酸性細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量的絕對值有差異趨勢，但是沒有統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）（圖2）。

2.3 MIP-1γ和IGFBP-6 mRNA水平顯著上調(diào)

上述結(jié)果提示淋巴細(xì)胞等細(xì)胞數(shù)量絕對值增加，TNF-α是重要的炎癥因子，而IGFBP-6和MIP-1γ在我們以前的蛋白芯片結(jié)果提示上調(diào)，而這些炎癥因子對淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞以及堿性淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)有著重要意義，所以我們對IGFBP-6，MIP-1γ和TNFα mRNA水平進(jìn)行檢測。提取兩種鼠的血液得到總mRNA，獲得cDNA，進(jìn)行real-time PCR檢測，結(jié)果如圖所示（圖3）小鼠血液中IGFBP-6、TNF-α、MIP-1γ均以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果顯示TNF-α（P＜0.01）、MIP-1γ升高（P＜0.05）（圖3）。

圖2 PSGL-1基因工程小鼠中外周血中血細(xì)胞變化情況Fig.2 Changes of blood cell counts in peripheral blood of the PSGL-1 knockout mice

圖3 相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的檢測Fig.3 The relative expression of cytokine factors in peripheral blood

3 討論

PSGL-1主要表達(dá)在白細(xì)胞上，其配基是 P-selectin、L-selection及E-selection，它是一種I型跨膜糖蛋白［7］。介導(dǎo)白細(xì)胞在內(nèi)皮上粘附、聚集及活化并釋放炎癥遞質(zhì)，參與炎癥過程，也存在白細(xì)胞粘附、活化的反饋機(jī)制［8-10］。靜息的血小板和內(nèi)皮細(xì)胞很少表達(dá)P-選擇素，在凝血酶、組胺、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素1β（interferon-1β，IL-1β）、脂多糖（lipopolysacchride，LPS）、氧自由基、補(bǔ)體C5a、高血糖等剌激下，發(fā)生脫顆粒反應(yīng)，顆粒膜與細(xì)胞膜迅速融合，可使已儲存的P-選擇素于數(shù)分鐘內(nèi)在細(xì)胞表面表達(dá)，從而介導(dǎo)白細(xì)胞的俘獲，順血流方向沿內(nèi)皮細(xì)胞表面向損傷部位滾動，這是白細(xì)胞牢固粘附和移行外滲的最初亦是最關(guān)鍵的階段。另外，PSGL-1還可能與胸腺的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，影響T細(xì)胞的定位和T細(xì)胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育。最近的報(bào)道，一些白血病腫瘤細(xì)胞表達(dá)PSGL-1，而且最近報(bào)道PSGL-1表達(dá)在腫瘤細(xì)胞有助于前列腺癌的轉(zhuǎn)移。

我們的研究提示PSGL-1缺失后，影響了外周血的改變，淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等增加，我們推測可能PSGL-1影響了白細(xì)胞的發(fā)育或者影響了白細(xì)胞的遷移，其不能趨化到其他器官，導(dǎo)致血液中白細(xì)胞增加，另外，我們還檢測到CD3下調(diào)（未展示），而外周血中總淋巴細(xì)胞是顯著升高的，淋巴細(xì)胞還包括NK細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞等，另外，血常規(guī)儀原理是根據(jù)血細(xì)胞非傳導(dǎo)的性質(zhì)和引起的電阻變化進(jìn)行檢測為基礎(chǔ)所進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)和體積測定。而流式細(xì)胞的檢測原理基于正電或負(fù)電的液滴通過高壓偏轉(zhuǎn)板時(shí)發(fā)生向陰極或向陽極的偏轉(zhuǎn)，從而達(dá)到了分類收集細(xì)胞的目的。

進(jìn)一步的mRNA水平檢測，也證實(shí)PSGL-1缺失的基因工程小鼠中MIP-1γ的變化和TNFα表達(dá)發(fā)生改變，而NCBI生物信息學(xué)提示MIP-1γ主要表達(dá)在髓細(xì)胞和單核細(xì)胞，從外周血中的變化（圖2）也證實(shí)了PSGL-1可能影響了髓細(xì)胞的分化或其它信號通路，大量研究的證明PSGL-1影響了炎癥的發(fā)生和免疫的穩(wěn)態(tài)調(diào)控［1］。但是PSGL-1如何影響MIP-1γ的變化還不是很清楚，需要我們更進(jìn)一步的探索。

腫瘤壞死因子-α最初發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤的生長以及可以誘導(dǎo)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞P選凝素的表達(dá)，是一種涉及到系統(tǒng)性炎癥的細(xì)胞因子。主要由巨噬細(xì)胞分泌，其它類型的細(xì)胞也能產(chǎn)生。腫瘤壞死因子α的主要作用是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。作為一種內(nèi)源性致熱原，它能夠促使發(fā)熱，引起細(xì)胞凋亡，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1和IL-6，引發(fā)炎癥，或阻止腫瘤發(fā)生和病毒復(fù)制。但是，當(dāng)機(jī)體中TNF-α超過一定量時(shí)，TNF-α與其他多種炎性因子一起，反而能促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展及產(chǎn)生多種病理性損傷［11-14］。而本研究結(jié)果證實(shí)PSGL-1的缺失會使TNF-α升高，文獻(xiàn)報(bào)道，Wnt途徑參與白細(xì)胞在炎癥中的反應(yīng)，如調(diào)節(jié)單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的遷移作用［15］。上述結(jié)果提示PSGL-1的缺失可能與炎癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)系。

綜上所述，PSGL-1作為白細(xì)胞上的膜蛋白，參與白細(xì)胞的活化、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而參與了炎癥的形成和發(fā)展。我們以前發(fā)現(xiàn)PSGL-1缺失的腸道腫瘤惡化加劇，其PSGL-1通過炎癥促進(jìn)腫瘤發(fā)展的機(jī)制有待深入研究。

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Expression of MIP-1γ and TNF-α in PSGL-1 knockout mice

LI Jiang-chao，ZHOU Ze-qi，YE Jie，HAN Lu，YE Yu-xiang，LIU Ying，HE Xiao-dong，CHEN Hui，YUAN Qiao-bing，LI Shuai，ZHANG Jing-li，WANG Li-jing
（Institute of Vascular Biology，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

ObjectiveTo investigate the effect of loss of PSGL-1 on routine blood test results in PSGL-1 knockout（PSGL-1-/-）mice，and to detect the expression levels of cytokines IGFBP-6，TNF-α and MIP-1γ mRNA in their peripheral blood.MethodsTo detect the differences in routine blood test results of normal C57/BL/6 mice and PSGL-1-/-mice.To prepare cDNA from isolated blood mRNA，and to analyze the differences in expression of cytokines TNF-α and MIP-1γ mRNA in peripheral blood of the C57 mice（control）and PSGL-1-/-mice by real-time PCR.Results Compared with the C57 control mice，the 12-week old PSGL-1-/-mice showed significantly increased neutrophils（P＜0.05），lymphocytes（P＜0.01）and total leukocyte counts（P＜0.001），and increased expression levels of TNF-α and MIP-1γ mRNA in the peripheral blood（P＜0.05）.ConclusionsOur findings suggest that the loss of PSGL-1 changes the cell counts of peripheral blood in mice.The up-regulation of cytokines MIP-1γ and TNF-α may influence the immune function of the mice.

PSGL-1；TNF-α；MIP-1γ；Transgenic mice；Peripheral blood

王麗京（1962-），女，博士，教授，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)。E-mail：wanglijing62@163.com。

R33

A

1671-7856（2014）02-0070-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.015

國家自然基金（31271455）廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（A2013312）。

李江超，男，博士。E-mail：lijiangchao@gdpu.edu.cn。

2013-12-11

技術(shù)方法