氣道高反應(yīng)動物模型的建立與指標(biāo)檢測

張碩峰，溫麗娜，吳金英，賈占紅，丁 巖，孫建寧

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

氣道高反應(yīng)動物模型的建立與指標(biāo)檢測

張碩峰，溫麗娜，吳金英，賈占紅，丁 巖，孫建寧

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

目的通過重新評價卵蛋白致小鼠哮喘模型，尋找一種簡便易行的氣道高反應(yīng)動物模型和相應(yīng)的檢測指標(biāo)，為研發(fā)治療本類疾病藥物和研究氣道高反應(yīng)發(fā)病機制提供新的實驗手段。方法小鼠采用卵白蛋白（OVA）致敏；致敏后（15～21）d給予10％OVA霧化吸入激發(fā)哮喘，在末次激發(fā)24h內(nèi)測量小鼠辣椒素引咳的半數(shù)有效濃度，處死小鼠取肺組織測定勻漿中NO、IL-13、ET-1的含量。結(jié)果卵蛋白致敏模型小鼠隨辣椒素濃度的升高其咳嗽反應(yīng)陽性率、咳嗽次數(shù)明顯增加（與對照組相比較P＜0.01）。模型組辣椒素引咳的半數(shù)有效濃度為89.39μmol/L，對照組、地塞米松組分別為204.84、220.02μmol/L；小鼠肺勻漿NO、ET-1、IL-13含量均明顯增加，地塞米松可明顯抑制NO的升高（與對照組相比較P＜0.01）。結(jié)論小鼠經(jīng)卵蛋白致敏并連續(xù)激發(fā)7d與臨床氣道高反應(yīng)性（AHR）的多種特征相似，操作簡便易行，穩(wěn)定性高，故可作為氣道高反應(yīng)性的模型。辣椒素引咳閾值的測定、動物肺組織中NO、IL-13、ET-1含量的變化，可作為評價模型嚴(yán)重程度的指標(biāo)。

氣道高反應(yīng)性；辣椒素；NO；IL-13；ET-1；小鼠

氣道高反應(yīng)性（airway hyperresponsiveness，AHR）指因氣道炎癥而處于的過度反應(yīng)狀態(tài)，表現(xiàn)出敏感而過強的支氣管平滑肌收縮反應(yīng)，引起氣道狹窄和氣道阻力增加，從而引發(fā)咳嗽、胸悶、呼吸困難和喘息等癥狀。常見于上呼吸道感染恢復(fù)后期，出現(xiàn)咳嗽等呼吸道癥狀，可持續(xù)數(shù)周至數(shù)月，經(jīng)常被誤診為支氣管炎、喘息性支氣管炎或肺炎。近年來其藥物治療已經(jīng)倍受關(guān)注。但目前尚無經(jīng)典的氣道高反應(yīng)動物模型，人們經(jīng)常針對氣道高反應(yīng)發(fā)病病理過程的不同環(huán)節(jié)使用食管鹽酸滴入、臭氧吸入應(yīng)激、卵蛋白致敏等動物模型替代［1，2］，缺乏系統(tǒng)評價。本研究試圖通過使用臨床常用的辣椒素檢測，重新評價卵蛋白致小鼠哮喘模型的氣道反應(yīng)性，尋找一種簡便易行的氣道高反應(yīng)動物模型和相應(yīng)的檢測指標(biāo)，為研發(fā)治療本類疾病藥物和研究氣道高反應(yīng)發(fā)病機制提供新的實驗手段。

1 材料和方法

1.1 動物

Balb/c小鼠，雌雄各半，體重（12～14）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2006-0009，合格證號：0157200。

1.2 藥物與試劑

醋酸地塞米松片：天津太平洋制藥有限公司產(chǎn)品。批號：070404。規(guī)格：0.75mg/片。人用量為1～4片/次，2～4次/日；即1.5～12mg/60kg/日。小鼠受試劑量為：0.5mg/kg。氫氧化鋁（AR）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20080428。雞卵白蛋白（OVA）：Ⅴ級（美國Sigma公司產(chǎn)品）。辣椒素（250mg）：美國Sigma公司，批號：00919EJ。IL-13 ELISA試劑盒：美國BG公司，批號：091202。NO ELISA試劑盒：上海森雄公司，批號：0912002。ET-1試劑盒由東直門醫(yī)院放免實驗室提供。

1.3 儀器

YLS-8A多功能誘咳引喘儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站產(chǎn)品。Denley Dragon Wellscan MK酶標(biāo)儀：Thermo公司產(chǎn)品（芬蘭）。Wellwash 4 MK2洗板機：Thermo公司產(chǎn)品（芬蘭）。TGL-168型離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。A02AI超聲波霧化器：上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.4 模型的制備及分組給藥

小鼠隨機分成3組（對照組、模型組、地塞米松組）。第1日模型及給藥組每只小鼠腹腔注射20μg卵白蛋白（OVA）和2mg氫氧化鋁（混合于0.5mL生理鹽水中），對照組腹腔注射等量生理鹽水；第8日模型及給藥組注射20μg OVA和2mg氫氧化鋁（混合于0.5mL生理鹽水中），對照組腹腔注射等量生理鹽水。第15日開始將模型及給藥組小鼠置于封閉容器中，給予10％OVA霧化吸入激發(fā)哮喘；對照組小鼠給予等量生理鹽水，每日1次，每次30min，連續(xù)7d；并在24h內(nèi)處死動物。給藥方法：從哮喘模型致敏的第8日開始，地塞米松組小鼠喂飼地塞米松0.5mg/kg/d，模型組及對照組小鼠灌服等量飲用水。

1.5 模型動物辣椒素咳嗽敏感性試驗

辣椒素30.5mg+吐溫80 1mL及無水乙醇1mL溶解，然后加入生理鹽水8.0mL，配成1mmol/L的辣椒素溶液，用生理鹽水稀釋至62.5、100、125、200、250μmol/L的5個濃度溶液。將20mL不同濃度的辣椒素分別放入多功能誘咳引喘儀的藥物池中，于末次給藥后24h內(nèi)將各組小鼠放入誘咳引喘儀，引咳。從低濃度開始，依次霧化吸入上述濃度的辣椒素溶液15s（間隔10min），停止給藥，觀察開始吸入辣椒素3min內(nèi)小鼠咳嗽次數(shù)，以咳嗽次數(shù)大于10次為陽性標(biāo)準(zhǔn)，計算陽性率，并行卡方檢驗；運用DAS軟件計算辣椒素引咳的半數(shù)有效濃度。

1.6 模型動物肺組織NO、ET-1、IL-13含量的測定

末次給藥后24h內(nèi)，處死小鼠，取肺組織，稱重，加入生理鹽水配制成10％的勻漿，于3 000r/min離心10min，取上清液，將肺勻漿樣品于-20℃條件下凍存，備用。采用ELISA法測定勻漿中NO、IL-13的含量，采用放免法測定ET-1的含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

咳嗽次數(shù)計算陽性率，并行卡方檢驗；其它數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較方差齊者用LSD檢驗，不齊者用Dunnett's T3檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型動物對辣椒素咳嗽敏感性的測定

結(jié)果表明，隨辣椒素濃度的升高動物的咳嗽反應(yīng)陽性率相映升高。經(jīng)卵蛋白致敏并連續(xù)激發(fā)7d的小鼠咳嗽反應(yīng)陽性率、咳嗽次數(shù)較對照組明顯增加（與對照組相比較P＜0.01）。運用DAS軟件計算辣椒素引咳的半數(shù)有效濃度，表明模型組辣椒素引咳的半數(shù)有效濃度為89.39μmol/L，對照組、地塞米松組分別為204.84、220.02μmol/L，提示小鼠經(jīng)卵蛋白致敏并連續(xù)激發(fā)7d后氣道高反應(yīng)性明顯升高，使用地塞米松可抑制這一反應(yīng)過程（表1、2）。

表1 不同劑量辣椒素對氣道高反應(yīng)模型小鼠的致咳作用的發(fā)生率（±s）Tab.1 The incidence of cough reflex induced by capsaicin of the mouse models of AHR（±s）

表1 不同劑量辣椒素對氣道高反應(yīng)模型小鼠的致咳作用的發(fā)生率（±s）Tab.1 The incidence of cough reflex induced by capsaicin of the mouse models of AHR（±s）

注：*P＜0.05、＊＊P＜0.01，與模型組比較Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the model group.

組別Groups劑量Dose辣椒素（陽性動物數(shù)/動物數(shù)）Capsaicin（positive number/Mouse number） 62.5 μmol/L 100 μmol/L 125 μmol/L 200 μmol/L 250 μmol/L對照組Control group - 0/26 0/26＊＊ 1/26＊＊ 13/26＊＊ 19/26*模型組Model group - 1/26 20/26 23/26 26/26 26/26地塞米松組Dexamethasone group 0.5mg/kg 0/26 0/26＊＊ 1/26＊＊ 10/26＊＊ 17/26＊＊

表2 氣道高反應(yīng)模型小鼠辣椒素引咳的半數(shù)有效濃度（±s，n=26）Tab.2 ED50of cough induced by capsaicin of the mouse models of AHR（±s，n=26）

表2 氣道高反應(yīng)模型小鼠辣椒素引咳的半數(shù)有效濃度（±s，n=26）Tab.2 ED50of cough induced by capsaicin of the mouse models of AHR（±s，n=26）

組別Groups劑量Dose辣椒素引咳半數(shù)有效濃度（μmol/L） ED50（μmol/L）對照組Control group - 204.84±19.67模型組Model group - 89.39±7.71地塞米松組Dexamethasone group 0.5mg/kg 220.02±23.80

2.2 模型動物肺組織NO、ET-1、IL-13含量的測定

結(jié)果表明：經(jīng)卵蛋白致敏并連續(xù)激發(fā)7d的小鼠肺勻漿NO、ET-1、IL-13含量均明顯增加，地塞米松可明顯抑制這些指標(biāo)的升高（與對照組相比較P＜0.01）。結(jié)果見表3。

3 討論

氣道反應(yīng)性是指氣道對各種化學(xué)、物理或藥物刺激的收縮反應(yīng)。氣道高反應(yīng)性（AHR）是指氣道對正常不引起或僅引起輕度應(yīng)答反應(yīng)的非抗原性刺激物出現(xiàn)過度的氣道收縮反應(yīng)。AHR引起氣道狹窄和氣道阻力增加，從而引發(fā)咳嗽、胸悶和喘息等癥狀。AHR常有家族傾向，受遺傳因素影響，但外因性的作用更為重要。目前普遍認(rèn)為氣道炎癥是導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性最重要的機制之一［3］。故本研究選用地塞米松作為驗證模型的陽性藥［4］。

臨床上經(jīng)常選用辣椒素來檢測患者的氣道反應(yīng)性，且臨床研究表明辣椒素在咳嗽激發(fā)試驗過程是安全的［5］。辣椒素作為咳嗽刺激劑，它的引咳機制較為明確：主要通過興奮辣椒素敏感受體（vanilloid type 1，VR1）誘發(fā)咳嗽［6-9］。故本研究通過測定小鼠對辣椒素的敏感性，來評價其氣道反應(yīng)性的高低。實驗結(jié)果表明，小鼠經(jīng)卵蛋白致敏并連續(xù)激發(fā)7d后能明顯增加降低辣椒素引咳的閾值，咳嗽次數(shù)，提高咳嗽反應(yīng)的陽性率，提示小鼠的氣道反應(yīng)性的升高。

IL-13在AHR的發(fā)生過程中起決定性作用。研究表明，引入外源性IL-13可直接引起AHR的途徑，但是如果IL-13缺失，則ARH不能產(chǎn)生［10］。IL-13可激活趨化因子，誘導(dǎo)和加重呼吸道炎癥。IL-13直接作用于氣道平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生NO，可以在沒有氣道炎癥的情況下誘發(fā)AHR［11］。IL-13還能引起呼吸道杯狀細(xì)胞增生及黏液過度分泌［12］，參與維持氣道粘膜Th2細(xì)胞因子的表達(dá)，促進嗜酸性粒細(xì)胞聚集，誘導(dǎo)5-脂加氧酶的表達(dá)，從而導(dǎo)致半胱氨酰白三烯的增加，提高氣道反應(yīng)性［13］。此外，IL-13能夠促進B細(xì)胞分化，減少調(diào)亡并誘導(dǎo)B細(xì)胞合成過多的IgE。IgE可以介導(dǎo)變應(yīng)性炎癥，結(jié)合許多效應(yīng)細(xì)胞表面的受體，引起炎性介質(zhì)的釋放，從而導(dǎo)致AHR和增強粘液分泌［11］。因此抑制IL-13或其受體的表達(dá)可以降低AHR。

表3 氣道高反應(yīng)模型小鼠肺勻漿NO、ET-1、IL-13的含量（±s，n=26）Tab.3 The contents of NO，ET-1，IL-13 in the lung homogenate of the mouse models of AHR

表3 氣道高反應(yīng)模型小鼠肺勻漿NO、ET-1、IL-13的含量（±s，n=26）Tab.3 The contents of NO，ET-1，IL-13 in the lung homogenate of the mouse models of AHR

注：*P＜0.05、＊＊P＜0.01，表示同模型組比較。Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the model group.

組別Groups 劑量Dose NO（pg/g pro） ET-1（pg/g pro） IL-13（pg/g pro）對照組Control group - 1.70±0.79＊＊ 134.1±48.1＊＊ 297.78±49.30*模型組Model group - 15.78±4.25 395.9±79.0 341.01±46.40地塞米松組Dexamethasone group 0.5mg/kg 3.23±0.72＊＊348.4±111.7 341.38±52.94

氣道上皮細(xì)胞在各種細(xì)胞因子及環(huán)境刺激因素的作用下可分泌內(nèi)皮素-1（ET-1）及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）并活化各種生長因子，這些因子共同作用于上皮下成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，使之增殖而引起氣道重塑［14］。研究認(rèn)為氣道基質(zhì)細(xì)胞ET-1的自分泌及旁分泌以及細(xì)胞因子與ET-1的相互作用，在AHR的形成過程中具有重要作用［15］。氣道重構(gòu)是導(dǎo)致AHR的直接因素，此時氣道壁的厚度與氣道開始收縮的閾值成反比關(guān)系，輕微的刺激即可引起明顯的收縮反應(yīng)，而輕度的支氣管收縮亦引起氣道阻力的明顯增加。NO在AHR的發(fā)生發(fā)展過程中具有雙重作用，一方面NO在氣道平滑肌張力調(diào)節(jié)和肺部免疫防御中發(fā)揮重要作用；另一方面，局部大量的NO產(chǎn)生可擴張支氣管粘膜血管，增強毛細(xì)管滲出，導(dǎo)致氣道粘膜水腫，加重氣道阻塞、組織損害，氣道平滑肌肥大、增生而使支氣管對刺激的收縮反應(yīng)更強烈并最終誘發(fā)AHR［16，17］。因此NO是影響氣道重建的重要因素。

本研究結(jié)果證實小鼠經(jīng)卵蛋白致敏并連續(xù)激發(fā)7d后肺組織勻漿中IL-13、NO以及ET-1含量的明顯增加。與AHR發(fā)生機制相符。

由此可見，小鼠經(jīng)卵蛋白致敏并連續(xù)激發(fā)7d與臨床氣道高反應(yīng)性（AHR）的多種特征相似，操作簡便易行，穩(wěn)定性高，故可作為氣道高反應(yīng)性的模型。辣椒素引咳閾值的測定、動物肺組織中NO、IL-13、ET-1含量的變化，可作為評價模型嚴(yán)重程度的指標(biāo)。

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Establishment of mouse models of airway hyperresponsiveness and their evaluation indicators

ZHANG Shuo-feng，WEN Li-na，WU Jin-ying，JIA Zhan-hong，DING Yan，SUN Jian-ning
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

ObjectiveTo reappraise the mouse model of ovalbumin（OVA）-induced asthma and to develop a new model of airway hyperresponsiveness（AHR）and its evaluation indicators.MethodsMice were sensitized with ovalbumin（OVA）and induced asthma by inhalation of 10％OVA at 15-21 days after the sensitization.The threshold value of capsaicin cough sensitivity test，and content of NO，ET-1，IL-13 in the lung homogenate were measured at 24 h after the last inhalation.ResultsThe positive rate of cough reflex aroused by capsaicin was significantly increased with the raise of concentration of capsaicin（compared with the control group，P＜0.01）.The ED50of capsaicin cough of the model group was 89.39 μmol/L，significantly lower than that of the control group（204.84 μmol/L）and dexamethasone group（220.02 μmol/L）.The contents of NO，ET-1，IL-13 in the lung homogenate of the model group were significantly increased，and dexamethasone significantly inhibited the increase of NO（compared with the control group，P＜0.01）.ConclusionsThe characteristics of the OVA-sensitized mouse model are resemble to that of clinical airway hyperresponsiveness.This model is simple to generate and stable，therefore，can be used as a model of AHR.The threshold value of capsaicin cough sensitivity test and the content of NO，ET-1，IL-13 in the lung homogenate can be used to evaluate the disease severity of the mouse models.

Airway hyperresponsiveness；Capsaicin；NO；IL-13；ET-1；Mouse

R33

A

1671-7856（2014）02-0020-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.005

北京中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新團隊資助項目（編號：2011-CXTD-12）。

張碩峰（1969-），男，副教授，研究方向：中藥防治重大疾病創(chuàng)新藥物研究，E-mail：shuofengzhang@sina.com。

孫建寧（1952-），女，教授，研究方向：中藥防治重大疾病創(chuàng)新藥物研究，E-mail：jn_sun@sina.com。

2013-12-05