創(chuàng)傷弧菌的優(yōu)化培養(yǎng)及快速檢測(cè)

鄧 曦，唐書(shū)澤，*，周鵬飛，李紅愛(ài)，吳希陽(yáng)，馬 強(qiáng)

（1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632；2.暨南大學(xué)微生物學(xué)系，廣東廣州 510632）

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）普遍存在于溫帶溫暖水生環(huán)境中，屬兼性厭氧型微生物，在海洋、鹽湖和淡水中廣泛分布，為全球重要的海洋致病細(xì)菌，與霍亂弧菌、腸炎弧菌并稱為造成人類(lèi)感染疾病的三大弧菌。該菌可通過(guò)進(jìn)食生海鮮或皮膚傷口而感染，臨床上常造成嚴(yán)重的敗血癥及肢體壞死，病發(fā)過(guò)程相當(dāng)迅速且死亡率高，并且嚴(yán)重的傷口感染，會(huì)引起胃腸道感染，70%的患者在入院48h內(nèi)因多臟器功能不全而死亡，它被稱為“海洋中的無(wú)聲殺手”[1-2]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于創(chuàng)傷弧菌感染的報(bào)道逐漸增多，創(chuàng)傷弧菌造成的食品污染日益受到人們廣泛關(guān)注。我國(guó)水域廣闊，海產(chǎn)品豐富，準(zhǔn)確快速檢測(cè)海產(chǎn)品中的可能污染的創(chuàng)傷弧菌對(duì)水產(chǎn)品安全具有重要意義。

目前，檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的方法主要有各種選擇性培養(yǎng)基、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)、核酸薄膜層析法、實(shí)時(shí)定量熒光PCR等方法[3-5]，此外，PCR結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù)也逐步得到發(fā)展[6]。生化特征目前仍是創(chuàng)傷弧菌鑒定分類(lèi)的常用方法，然而該菌在不良環(huán)境中易進(jìn)入非可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC）[7]，導(dǎo)致鑒定結(jié)果呈假陰性，但一定條件下恢復(fù)培養(yǎng)后，該菌仍保持致病性。另外，該菌的生化特征不穩(wěn)定，給其鑒定帶來(lái)很大困難和不確定性[8]。

創(chuàng)傷弧菌的準(zhǔn)確檢測(cè)以菌種的有效培養(yǎng)為前提，優(yōu)化創(chuàng)傷弧菌的培養(yǎng)條件，有利于對(duì)其快速、高效檢出。本實(shí)驗(yàn)選用創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27562為實(shí)驗(yàn)菌，通過(guò)對(duì)各種培養(yǎng)條件的探索，尋求創(chuàng)傷弧菌的最佳培養(yǎng)條件，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合PCR技術(shù)進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27562 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、蛋白胨（APW）、多粘菌素B、2216E液體培養(yǎng)基、TCBS瓊脂培養(yǎng)基、mCPC瓊脂培養(yǎng)基、3%NaCl胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA） 青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 生工生物有限公司；1×Taq PCR MasterMix 天根生化科技（北京）有限公司；目的片段 針對(duì)創(chuàng)傷弧菌的特異基因thl設(shè)計(jì)引物，根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成其序列如下，上游引物：Vvh-785F 5′-CCGCGG TACAGGTTGGCGCA-3′；下游引物：Vvh-1303R 5′-CGCCACCCACTTTCGGGCC-3′，目的片段大小為519bp。

酶標(biāo)儀MK3（Thermo Labsystems） 美國(guó)賽默飛世爾；PHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁分析儀器廠；梯度PCR儀 Eppendorf公司；數(shù)碼成像系統(tǒng) KODAK公司；高速離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的篩選 APW，APW+多粘菌素B，TSB，2216E液體培養(yǎng)基各10mL，分裝于12支15mL離心管中（2組平行），滅菌后備用。向每只管中添加等量創(chuàng)傷弧菌菌液，37℃增菌培養(yǎng)16h，取菌液100μL，以1∶10梯度稀釋涂布于mCPC及TCBS平板上，培養(yǎng)24h后觀察。

1.2.2 菌體生長(zhǎng)影響因素探究 通過(guò)1.2.1觀察平板菌落總數(shù)，確定出最佳增菌液。取培養(yǎng)于APW+多粘菌素B 16h的最佳增菌液200μL接種于10mL TSB培養(yǎng)基中，2組平行，使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 不同鹽度對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)影響 向增菌液中添加不同量的NaCl，使鹽濃度達(dá)到0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，用以優(yōu)選適宜創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基鹽度范圍。取10μL菌液分別接種于液體培養(yǎng)基中，35℃下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、3、5、6、7、8、9、10h取樣，并使用酶標(biāo)儀（595nm）測(cè)定菌液吸光度值，并繪制曲線圖。

1.2.3.2 不同pH對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)影響 使用含0.5%NaCl的TSB液體培養(yǎng)基，將其pH分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0，取10μL菌液分別接種于液體培養(yǎng)基中，35℃下培養(yǎng)，其余操作同1.2.3.1。由此篩選出適宜創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)的pH范圍。

1.2.3.3 不同溫度對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)影響 取200μL菌液分別接種于含0.5%NaCl的TSB液體培養(yǎng)基中，于25、30、35、40、45℃下培養(yǎng)，其余操作同1.2.3.1，從中測(cè)定創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)的適宜溫度。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)受諸多因素的影響，而且創(chuàng)傷弧菌的感染具有明顯的季節(jié)特征，在創(chuàng)傷弧菌的培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基含鹽量、pH以及培養(yǎng)溫度對(duì)創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)均有較大影響[10-11]。本研究利用Design-Expert 8.05軟件中的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)一組3因素3水平的共計(jì)17組的實(shí)驗(yàn)。

表1 實(shí)驗(yàn)的因素及水平編碼Table 1 Code of factors and levels

1.3 菌體的快速檢測(cè)

利用響應(yīng)曲面法得出最優(yōu)參數(shù)，采用優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)創(chuàng)傷弧菌ATCC27562及五月市售海鮮（翡翠貽貝）進(jìn)行培養(yǎng)，用試劑盒法提取細(xì)菌DNA，并采用PCR進(jìn)行檢測(cè)。

PCR反應(yīng)體系（50μL）為：PCR Master Mix 25μL，Primer F及Primer R（0.4μmol·L-1）各1μL，模板DNA 2μL，ddH2O 21μL。

PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，63.5℃退火30s，72℃延伸35s，循環(huán)25次，72℃再延伸5min。

用TAE緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠，采用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)樣5μL，電壓80V，電泳40min，檢測(cè)和分析電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 鹽度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 Andrea等[12]研究發(fā)現(xiàn)高鹽度的環(huán)境可抑制創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)，當(dāng)鹽度為1.5%左右時(shí)，該菌生長(zhǎng)良好，受到最少抑制。而由本實(shí)驗(yàn)（如圖1）可以看出，鹽度在0.5%～5%時(shí)，創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)良好，尤其濃度在1%～4%時(shí)生長(zhǎng)速率較快，而鹽度達(dá)到10%基本不生長(zhǎng)，這是因?yàn)樵邴}度較高的情況下，菌體滲透壓變化，引起細(xì)菌胞漿分離或脫水而死亡[13]。

圖1 鹽度對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of salinity on growth of Vibrio vulnificus ATCC27562

2.1.2 pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 培養(yǎng)基的pH必須控制在一定范圍內(nèi)，以滿足細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，各類(lèi)微生物生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的最適pH各不相同[14]。pH對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖2，pH在5～9時(shí)，菌體均可生長(zhǎng)，在pH過(guò)高或過(guò)低的條件下，菌體幾乎不能生長(zhǎng)，其中pH 6～8時(shí)，菌體生長(zhǎng)最佳。Bang等[15]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌可以承受的最低酸度為pH3.5，并且只能在此環(huán)境中生存約50h，而在pH4.0～5.0的環(huán)境中可以存活，但幾乎不能生長(zhǎng)，此與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

圖2 pH對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of pH on growth of Vibrio vulnificus ATCC27562

2.1.3 溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]，創(chuàng)傷弧菌在20℃以上時(shí)才開(kāi)始大量生長(zhǎng)繁殖，且在35℃左右生長(zhǎng)最快，據(jù)此設(shè)定單因素溫度區(qū)間為25～45℃。圖3表明，在30～40℃的條件下，菌體生長(zhǎng)較快，其中，當(dāng)溫度達(dá)到35℃左右時(shí)生長(zhǎng)狀況最佳。因此選擇30～40℃為創(chuàng)傷弧菌的最適生長(zhǎng)條件。

圖3 溫度值對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of temperature on growth of Vibrio vulnificus ATCC27562

2.2 響應(yīng)曲面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)曲面分析實(shí)驗(yàn) 通過(guò)酶標(biāo)儀在595nm下測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)菌液的OD值為響應(yīng)值（Y），響應(yīng)曲面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)曲面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析 用Design-Expert 8.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3，該模型的F值為7.504337，p=0.0073＜0.01，表明該模型具有意義；決定系數(shù)R2=0.9061表明該模型具有較高的可信度；該模型的失擬項(xiàng)在可接受范圍內(nèi)，說(shuō)明模型可用。根據(jù)數(shù)學(xué)模型對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次方多元回歸擬合可得到回歸方程為：Y=+0.48+0.044A-0.052B+0.059C+5.500E-003AB+0.10AC-0.020BC-0.081A2-0.037B2-0.092C2

2.2.3 響應(yīng)曲面交互作用分析 根據(jù)上述回歸方程繪出等高線圖及響應(yīng)曲面圖，以分析培養(yǎng)基含鹽量，pH，培養(yǎng)溫度3個(gè)因素對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)的交互作用。曲線越陡，說(shuō)明因素間的交互作用越強(qiáng)；圖形中曲面顏色越深的區(qū)域，說(shuō)明結(jié)果越顯著[18]。結(jié)果表明，培養(yǎng)基含鹽量與培養(yǎng)溫度的交互作用顯著，其他兩組交互作用不顯著。圖4、圖5表明，培養(yǎng)溫度及pH不變的條件下，在0.5%～5%的范圍內(nèi)，隨著鹽度的升高，弧菌生長(zhǎng)速率先升高后降低。圖6表明，溫度一定時(shí)，隨著培養(yǎng)基pH的升高，在一定范圍內(nèi)，弧菌的生長(zhǎng)速率先升后降。圖5、圖6表明，在鹽度及pH不變的條件下，隨著溫度的升高，創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)速率先增加后降低。

2.2.4 參數(shù)優(yōu)化與驗(yàn)證 在Design-Expert 8.05軟件中利用上述回歸方程對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，求解得各因素的理論最優(yōu)條件為：含鹽量3.65%，pH6.75，培養(yǎng)溫度37.00℃，在該條件下培養(yǎng)液的OD595nm理論值為0.530056。為檢驗(yàn)優(yōu)化條件的可靠性，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，實(shí)際測(cè)得在該條件下595nm下的OD值為0.520，與理論預(yù)測(cè)值相比，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為98.1%，由此表明利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化的培養(yǎng)條件是可行的。

圖4 培養(yǎng)基含鹽量與pH對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of salinity and pH on growth of Vibrio vulnificus ATCC27562

圖5 培養(yǎng)基含鹽量與培養(yǎng)溫度對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of salinity and temperature on growth of Vibrio vulnificus ATCC27562

圖6 培養(yǎng)基的pH與培養(yǎng)溫度對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of PH and temperature on growth of Vibrio vulnificus ATCC27562

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果

從圖7看來(lái)，采用優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)不同來(lái)源的創(chuàng)傷弧菌的菌株，通過(guò)PCR實(shí)驗(yàn)可以準(zhǔn)確檢測(cè)到不同來(lái)源的創(chuàng)傷弧菌的菌株。從30份樣品中篩出可能污染創(chuàng)傷弧菌的樣品有7份，將可疑樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果呈陽(yáng)性，如圖8所示。陳艷等[19]采用生化實(shí)驗(yàn)及PCR法得出，東南沿海地區(qū)天然污染海產(chǎn)品試樣創(chuàng)傷弧菌的檢出率為19.8%；鄧志愛(ài)等[20]通過(guò)對(duì)海產(chǎn)品的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，廣東地區(qū)的創(chuàng)傷弧菌的檢出平均水平為9.06%，其中生食海產(chǎn)為42.86%，非生食海產(chǎn)為6.56%，而且檢出的污染水平有明顯季節(jié)差異。在本實(shí)驗(yàn)中，創(chuàng)傷弧菌的檢出率高達(dá)23.3%（7/30），而且整個(gè)操作過(guò)程簡(jiǎn)單易行，經(jīng)濟(jì)節(jié)省，所需時(shí)間也較短。

圖7 不同來(lái)源創(chuàng)傷弧菌-瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.7 Electrophoresis of Vibrio vulnificus注：1：Marker；2～13：不同菌落提取的DNA。

圖8 不同海產(chǎn)樣品的電泳圖Fig.8 Electrophoretograms of Vibrio vulnificus

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)以培養(yǎng)基含鹽量、pH、溫度三個(gè)因素為條件，用酶標(biāo)儀（595nm）測(cè)定一定時(shí)間點(diǎn)的菌液吸光度值，根據(jù)Design-Expert軟件的Box-Behnken中心組合響應(yīng)面分析法優(yōu)化出了最佳工藝參數(shù)為：含鹽量3.65%，pH6.75，溫度37.00℃，在該條件下菌液在595nm下的吸光度值的理論值0.530056，實(shí)際值為0.520，該模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為98.1%。該優(yōu)化培養(yǎng)基結(jié)合PCR-瓊脂糖凝膠電泳的方法，能方便快捷地檢出產(chǎn)品中的創(chuàng)傷弧菌，且檢出率高達(dá)23.3%。該條件參數(shù)的培養(yǎng)基價(jià)廉易得，PCR技術(shù)的應(yīng)用也非常廣泛。因此，該方法適合于創(chuàng)傷弧菌的優(yōu)化培養(yǎng)及快速檢測(cè)，具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

[1]吳斌，盧中秋.創(chuàng)傷弧菌感染的致病機(jī)制研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2004，24（11）：834-835.

[2]趙廣英，申科敏，勵(lì)建榮.水產(chǎn)品中多種致病性弧菌的分離鑒定[J].食品科技，2009，34（11）：279-282.

[3]何閃閃，薛長(zhǎng)湖，李兆杰，等.水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的快速檢測(cè)與分離[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2005（3）：86-89.

[4]石琰璟，王建廣.PCR-核酸薄膜層析法檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌[J].青島科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版2012，33（2）：164-167.

[5]劉彤，鄭秋月，趙昕，等.變性高效液相色譜技術(shù)對(duì)創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)的研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志2011，23（5）：470-472.

[6]Oliver JD，Hite F，McDougald D，et al.Entry into，and resuscitation from，the viable but nonculturable state by Vibrio vulnificus in an estuarine environment[J].Applied and Environment Microbi-ology，1995，61：2624-2630.

[7]鐘凱，田靜，李業(yè)鵬，等.食品中副溶血性弧菌PCR快速檢測(cè)方法的研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2004，16（4）：317-320.

[8]Ji H，Chen Y，Guo YC，et al.Occurrence and characteristics of Vibrio vulnificus in retail marine shrimp in China[J].Food Control，2011，22：1935-1940.

[9]Staley C，Chase E，Harwood VJ.Detection and differentiation of Vibrio vulnificus and Vibrio Sinaloensis in water and oysters of a Gulf of Mexico estuary[J].Environmental Microbiology，2003，15（2）：623-633.

[10]Ruppert J，Panzig B，Guertler L，et al.Two cases of severe sepsis due to Vibrio vulnificus wound infection acquired in the Baltic Sea[J].European Journal of Clinical Microbiology&Infectious Diseases，2004，23：912-915.

[11]Williams TC，Brett F，Oliver JD.A new culture-based method for the improved identifi cation of Vibrio vulnificus from environmentalsamples，reducing the need for molecular confirmation[J].Journal of Microbiological Methods，2013，93：277-283.

[12]Larsen AM，Rikard FS，Walton WC，et al.Effective reduction of Vibrio vulnificus in the Eastern oyster（Crassostrea virginica）using high salinity depuration[J].Food Microbiology，2013，34：118-122.

[13]文湘華，占新民，王建龍，等.含鹽沸水生物處理研究進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)，1999，20（3）：104-106.

[14]江漢湖.食品微生物學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009.

[15]Bang W，Drake MA.Acid adaptation of Vibrio vulnificus and subsequent impact on stress tolerance[J].Food Microbiology，2005，22：301-309.

[16]Griffitt KJ，Grimes DJ.A novel agar formulation for isolation and direct enumeration of Vibrio vulnificus from oyster tissue[J].Journal of Microbiological Methods，2013，94：98-102.

[17]陳春梅，陳錦春.水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的選擇性分離[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2007，17（6）：37-39.

[18]Montgomery DC.Design and analysis of experiments[M].8Th Edition.New York：Wiley，2009.

[19]陳艷，梅玲玲，李秀桂，等.東南沿海地區(qū)零售海產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2009，21（4）：344-347.

[20]鄧志愛(ài)，李佳旋，李孝權(quán)，等.廣州地區(qū)海產(chǎn)品和珠江水中致病性弧菌污染狀況監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（5）：1237-1239.