響應(yīng)面分析法優(yōu)化紫茄皮花色苷的提取工藝

郭 菲，劉 繼，黃 彭，劉東杰，熊亞波，秦 文

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化紫茄皮花色苷的提取工藝

郭 菲，劉 繼，黃 彭，劉東杰，熊亞波，秦 文*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014)

以紫茄皮為研究對(duì)象，利用有機(jī)溶劑提取花色苷，并以花色苷提取液的吸光值作為提取效果指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化紫茄皮花色苷的提取條件。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溫度（℃）、液料比（mL/g）、提取時(shí)間作為自變量，A525V/m（V：提取劑用量，m：樣品質(zhì)量）作為響應(yīng)值，利用Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面分析法，研究各自變量及其交互作用對(duì)花色苷提取效果的影響，在提取劑為70%乙醇（含0.05%鹽酸，V/V）的條件下，確定最佳提取條件為提取溫度38℃、液料比19∶1mL/g、提取時(shí)間95min。在此工藝條件下，花色苷提取效果A525為12.752，與理論預(yù)測(cè)值12.876相差0.124。說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化后得出的方程具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

紫茄皮，花色苷，提取，響應(yīng)面分析法

茄子（eggplant），學(xué)名（SolanummelongenaL.），也叫落蘇、昆侖瓜，是茄科（Solanaceae）茄屬茄種的一年生草本植物，熱帶為多年生。茄子最早產(chǎn)于印度，公元4～5世紀(jì)傳入中國(guó)，全國(guó)大部地區(qū)有栽培[1]?；ㄇ嗨兀ˋnthocyanidin）類(lèi)為2－苯基苯并吡喃陽(yáng)離子衍生物，屬類(lèi)黃酮物質(zhì)的一種，結(jié)構(gòu)中有多個(gè)酚羥基或酚羥基與烷基或糖基而形成的醚或苷，當(dāng)分子中有糖基時(shí)稱(chēng)為花色苷[2]。花青素在自然界分布廣泛，是植物的主要水溶性色素之一。初步統(tǒng)計(jì)就有27個(gè)科72個(gè)屬的植物都含花青素[3]。人們?cè)噲D從各種動(dòng)植物資源中獲取天然色素，同時(shí)探索其生理活性，來(lái)緩解并解決由合成色素所帶來(lái)的各種問(wèn)題，因此天然色素具有廣泛的應(yīng)用潛力[4]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)花色苷的功能已有相關(guān)報(bào)道，在保健食品應(yīng)用中，這一類(lèi)植物色素具有抗氧化[5－7]、降低血脂[8]、增強(qiáng)人體免疫機(jī)能[9]等作用。目前，對(duì)紫茄皮花色苷的提取方法主要有有機(jī)溶劑提取法[10]、微波法[11]、超聲波法[12]和超臨界CO2萃取[13]等方法。在有些研究中，對(duì)比了溶劑法和超聲波提取法，由于超聲波的作用，使得提取液粘度增大，從而效果不理想?？梢?jiàn)，溶劑法要比超聲波法提取效果好[14－15]。而超臨界萃取法的設(shè)備和操作復(fù)雜，不主張作為主要的提取方法，所以在本實(shí)驗(yàn)中采用有機(jī)溶劑來(lái)提取紫茄皮中的花色苷。在國(guó)內(nèi)目前在食用茄子時(shí)多將茄子皮丟棄[16]，這不僅造成了資源浪費(fèi)也給環(huán)境造成負(fù)擔(dān)。本實(shí)驗(yàn)利用有機(jī)溶劑對(duì)紫茄皮中的花色苷提取進(jìn)行研究，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化紫茄皮中花色苷最佳提取工藝條件，為今后的紫茄皮的綜合開(kāi)發(fā)利用提供了可行性依據(jù)，為使用天然色素提供了基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫茄 購(gòu)于蔬菜批發(fā)市場(chǎng)；乙醇、鹽酸 均為分析純。

DHG－9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；V－3200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；BS210S型電子天平 塞多利斯北京天平有限公司；PHS－3C型酸度計(jì) 上海雷磁公司；W80高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫茄皮預(yù)處理 將紫茄洗凈，均勻削皮，烘箱30℃烘24h，粉碎，過(guò)40目標(biāo)準(zhǔn)篩，棕色瓶冷藏保存。

1.2.2 紫茄皮花色苷的提取 以70%乙醇（含0.05%鹽酸，V/V）為提取劑，40℃浸提90min，抽濾過(guò)后取上清液，40℃真空濃縮回收乙醇，得到花色苷濃縮液。

1.2.3 紫茄皮花色苷可見(jiàn)光最大吸收波長(zhǎng)的確定 取適量濃縮液用pH3.0檸檬酸－磷酸二氫鈉緩沖溶液稀釋?zhuān)€(wěn)定1h，200～700nm全波長(zhǎng)掃描，繪制光譜圖，并與文獻(xiàn)[17－18]中花色苷光譜進(jìn)行比較，同時(shí)確定可見(jiàn)光區(qū)最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.4 花色苷的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用單pH測(cè)定法[19]。將待測(cè)花色苷溶液的溶劑用緩沖溶液替換，把pH調(diào)節(jié)至3.0，再采用分光光度法，根據(jù)朗伯－比爾定律，即A=εbc，其中：ε為摩爾吸收系數(shù)，是吸光系數(shù)在給定的波長(zhǎng)和溶劑下的特征常數(shù)，所以在一定溫度和介質(zhì)條件下，ε為定值，b=1.0cm。因此在一定范圍內(nèi)A與花色苷的濃度成正比。本實(shí)驗(yàn)部分以吸光度Aλmax作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，衡量提取花色苷的提取效果。

1.2.5 提取工藝參數(shù)的確定

1.2.5.1 提取劑濃度的確定 以不同濃度乙醇（含0.05%鹽酸）為提取劑，其濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%。提取溫度40℃，液料比20∶1，提取時(shí)間90min，最后測(cè)定A525。

1.2.5.2 提取劑pH的確定 依據(jù)1.2.5.1研究基礎(chǔ)，選取70%乙醇為提取劑，用5%鹽酸和5%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH分別為1、2、3、4、5、6。提取溫度40℃，液料比20∶1，提取時(shí)間90min，最后測(cè)定A525。

1.2.5.3 單因素實(shí)驗(yàn) a.提取溫度的確定：準(zhǔn)確稱(chēng)取紫茄皮1.00g置于50mL三角瓶中，液料比為20∶1，封口浸提，遮光，浸提溫度為30、40、50、60、70、80℃，時(shí)間為90min，測(cè)定A525。

b.液料比的確定：準(zhǔn)確稱(chēng)取紫茄皮1.00g置于50mL三角瓶中，液料比為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，封口浸提，遮光，浸提溫度40℃，時(shí)間為90min，測(cè)定A525V/m。其中V為提取劑用量（mL），m為樣品量（g）。在提取的過(guò)程中，由于液料比不同則提取劑的體積不同，即不同的稀釋比例會(huì)有不同的測(cè)定值。在單因素的提取溫度和時(shí)間的實(shí)驗(yàn)中液料比為定值，不存在提取劑造成的體積差距而影響測(cè)定值，所以在料液比的實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)中以A525V/m來(lái)表示提取效果[20]。

c.提取時(shí)間的確定：準(zhǔn)確稱(chēng)取紫茄皮1.00g于50mL三角瓶中，液料比為20∶1，封口浸提，遮光，浸提溫度為40℃，時(shí)間為30、60、90、120、150、180min，測(cè)定A525。

1.2.6 紫茄皮花色苷提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在提取溫度、液料比、提取時(shí)間3個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，把單因素定為自變量，A525V/m定為花色苷提取效果指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)紫茄皮花色苷提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因子與水平表Table 1 Independent variables and their coded and actual values used for optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 紫茄皮花色苷的紫外-可見(jiàn)掃描光譜分析

圖1 紫茄皮花色苷紫外－可見(jiàn)掃描光譜圖Fig.1 UV－visible scanning spectrum of purple eggplant－peel anthocyanins

由圖1可知，紫茄皮花色苷有2個(gè)明顯的吸收峰，分別出現(xiàn)在320～340nm，52～530nm。其中320nm～340nm為有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)羧基的特征吸收峰，520～530nm為花色苷類(lèi)物質(zhì)特征吸收峰[21]。由圖1可知，在525nm出現(xiàn)可見(jiàn)光范圍內(nèi)的最大吸收波長(zhǎng)，并且紫茄皮色素為花色苷類(lèi)色素，因此選擇525nm作為實(shí)驗(yàn)的檢驗(yàn)波長(zhǎng)。

2.2 提取工藝參數(shù)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響 由圖2可知，在乙醇濃度為20%～70%時(shí)隨著乙醇濃度的增加提取量逐漸上升，在70%時(shí)達(dá)到最大值，吸光度為0.95，在乙醇濃度為70%～90%范圍內(nèi)隨著乙醇濃度的增加提取量逐漸降低，這主要是隨著乙醇濃度的增加導(dǎo)致溶液極性的改變使提取液中雜質(zhì)的含量增加，因此選擇70%的酸化乙醇作為提取劑。

圖2 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of alcohol concentrations on the extraction efficiency

2.2.2 pH對(duì)提取效果的影響 從表2可知，提取劑pH對(duì)色素提取效果有明顯影響，在pH1～3時(shí)，紫茄皮花色苷的提取量較高。因pH1.0強(qiáng)酸性條件下，加熱并長(zhǎng)時(shí)間提取時(shí)，容易發(fā)生花色苷部分水解[22]，所以選取提取劑pH3.0為最佳。經(jīng)測(cè)定，70%乙醇（含0.05%鹽酸）pH=2.86～2.98，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用70%（含0.05%鹽酸）作為提取劑。

2.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.3.1 溫度對(duì)紫茄皮花色苷提取效果的影響 液料比為20∶1，以70%（含0.05%鹽酸）乙醇作為提取劑，在不同溫度下提取90min。各條件3次重復(fù)。如圖3所示，在30～40℃范圍內(nèi)，花色苷提取效果隨著溫度的升高而上升，溫度升高增加了溶劑分子和活性物質(zhì)分子的動(dòng)能，加速了分子運(yùn)動(dòng)進(jìn)而促進(jìn)擴(kuò)散作用，在40℃時(shí)吸光度達(dá)到最大值1.0185，提取效果最好。在50～80℃范圍內(nèi)，花色苷提取效果隨溫度的升高而下降，80℃時(shí)提取效果最差，吸光值只有0.74。說(shuō)明提取溫度不能過(guò)高，過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致花色苷降解。因此提取溫度應(yīng)控制在40℃。本研究符合花色苷熱降解動(dòng)力學(xué)理論[23]。

圖3 溫度對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of temperature affect on the extraction efficiency

2.2.3.2 液料比對(duì)紫茄皮花色苷提取效果的影響 溫度40℃，以70%（含0.05%鹽酸）乙醇作為提取劑，在不同的液料比下提取90min。各條件3次重復(fù)。如圖4所示，在乙醇濃度、溫度、時(shí)間一定的情況下，液料比為15∶1～20∶1時(shí)，花色苷的提取效果呈上升趨勢(shì)，在液料比為20∶1時(shí)A525V/m最大為22.466。隨著液料比的增大提取效果變小，當(dāng)液料比在30∶1后，提取效果的變化較小，這主要是因?yàn)閷?duì)于固定原料的量隨著提取劑量的增加，溶質(zhì)能逐漸充分溶于提取劑中，所以A525V/m變化不大。因此選擇固定液料比在20∶1進(jìn)行下實(shí)驗(yàn)。

圖4 液料比對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effect of liquid－solid ratio on the extraction efficiency

2.2.3.3 提取時(shí)間對(duì)紫茄皮花色苷提取效果的影響

液料比20∶1，溫度為40℃，以70%（含0.05%鹽酸）乙醇作為提取劑，設(shè)定不同的提取時(shí)間。各條件3次重復(fù)。如圖5所示，乙醇濃度、提取溫度和液料比一定時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷的提取效果先升高，在90min時(shí)提取效果最好，吸光值達(dá)到0.752。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)90min后，提取效果呈下降趨勢(shì)。分析原因可能是在90min以前，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷的積累越來(lái)越多，但超過(guò)90min，長(zhǎng)時(shí)間的高溫破壞了花色苷的結(jié)構(gòu)，花色苷發(fā)生熱降解，加之光照及氧化作用，導(dǎo)致花色苷穩(wěn)定性下降[24]，故不宜在加熱情況下長(zhǎng)時(shí)間提取。因此提取時(shí)間應(yīng)該控制在90min。

圖5 時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.5 Time affect on the extraction efficiency

表2 pH對(duì)提取效果的影響Table 2 Effect of solvent pH on extraction yield（20∶1，40℃，90min）

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box－Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，總結(jié)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取液料比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)花色苷提取影響顯著的3個(gè)因素，采用Design Expert 8.0.6設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，分別用X1、X2、X3來(lái)表示提取溫度、液料比、提取時(shí)間，并以－1、0、+1分別代表變量的水平，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box－Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box－Behnken experimental design and result

2.3.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及數(shù)值分析 為了研究不同條件對(duì)紫茄皮花色苷制備的影響和確定最佳制備條件，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面曲面分析實(shí)驗(yàn)，在17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中有1～12是析因點(diǎn)，13～17是零點(diǎn)，也就是區(qū)域的中心點(diǎn)，利用這5個(gè)點(diǎn)可以估計(jì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)誤差。以A525V/m為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面分析法分析后，得到各實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響的二階多項(xiàng)式方程：

對(duì)二階多項(xiàng)式方程進(jìn)行分析，其結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，此響應(yīng)面回歸模型達(dá)到顯著水平（p＜0.05），且模型p=0.0001，表明模型的顯著性極高，不同處理之間的差異性極大。CV值為3較低，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作的可信度較高。

模型的調(diào)整系數(shù)R2Adj=94.59%（表4），說(shuō)明該模型能解釋94.59%的響應(yīng)值的變化，擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差較小。決定系數(shù)（R2）和調(diào)整系數(shù)（R2Adj）分別為97.63%和94.59%，具有很好的一致性，可以用此模型來(lái)對(duì)紫茄皮花色苷得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)[25]。對(duì)模型回歸方程系數(shù)的顯著性實(shí)驗(yàn)表明：影響花色苷提取效果的主要因素的次序是X2＞X1＞X3，二次項(xiàng)X12、X22、X32，交互項(xiàng)X1X2、X1X3顯著，表明提取溫度與液料比及提取溫度與提取時(shí)間等的交互作用等對(duì)紫茄皮花色苷的提取效果有較為顯著的影響[26－27]。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance Analysis of regression model

2.3.3 響應(yīng)面曲面分析 響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各因素所構(gòu)成的三維空間的曲面圖[28]。等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示兩個(gè)因素交互作用顯著[29]。為進(jìn)一步考察3個(gè)因素兩兩之間的交互作用對(duì)花色苷提取效果的影響，對(duì)其響應(yīng)面曲線進(jìn)行分析，從響應(yīng)面圖中找到優(yōu)化區(qū)域，在優(yōu)化區(qū)域內(nèi)通過(guò)調(diào)整各因素的數(shù)值大小來(lái)滿(mǎn)足花色苷提取過(guò)程中的實(shí)際需要，最終得到較好的花色苷提取條件。

2.3.3.1 提取溫度和液料比對(duì)花色苷提取效果的影響 由圖6可知，當(dāng)提取時(shí)間為90min時(shí)，隨著提取溫度和液料比的升高，紫茄皮花色苷提取效果先升高后降低，響應(yīng)面相對(duì)較陡，表明對(duì)提取溫度和液料比對(duì)花色苷提取效果的影響較大。一方面，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，花色苷會(huì)降解，不利于花色苷的穩(wěn)定。另一方面，隨著液料比的升高，花色苷的提取效果升高，但是當(dāng)超過(guò)一定范圍后，其提取效果不升反降。

圖6 提取溫度和液料比對(duì)花色苷提取效果影響的曲面線圖Fig.6 Response surface diagram of effect between extraction temperature and liquid－solid ratio

2.3.3.2 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)花色苷提取效果的影響 由圖7可知，響應(yīng)曲面的坡度較抖，表明花色苷的提取效果對(duì)提取溫度和提取時(shí)間的變化較敏感。特別是提取時(shí)間變化對(duì)花色苷提取效果的影響比提取溫度的影響大。提取溫度選擇35～45℃之間，提取時(shí)間選擇80～95min之間可以得到較好的花色苷提取效果。

圖7 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)花色苷提取效果影響的曲面線圖Fig.7 Response surface diagram of effect between extraction temperature and extraction time

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)Design－Expert 8.0.6軟件分析優(yōu)化，可得到紫茄皮花色苷最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度37.60℃、液料比18.90∶1mL/g、提取時(shí)間93.49min，在此最佳工藝條件下花色苷提取效果A525理論值為12.876?？紤]到可操作性，將最優(yōu)提取條件調(diào)整為提取溫度38℃、液料比19∶1mL/g、提取時(shí)間95min。用此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到花色苷提取效果A525為12.752，與理論預(yù)測(cè)值12.876僅相差0.124，兩者一致性高，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

本文以紫茄皮為原料，乙醇作為提取劑，花色苷提取液的吸光值作為提取效果指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化紫茄皮花色苷的提取條件。實(shí)驗(yàn)中不同濃度的乙醇對(duì)花色苷的提取效果不同，提取劑的pH同樣影響紫茄皮花色苷的提取效果。經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定，在紫茄皮中提取花色苷宜采用70%乙醇（含0.05%鹽酸）作為提取劑。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)可知，最佳的單因素組合為溫度40℃、時(shí)間90min、液料比20∶1。在單因素的基礎(chǔ)上利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design－Expert 8.0.6，采用Box－Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析對(duì)紫茄皮花色苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出了紫茄皮花色苷提取各因素變量的二次方程模型，該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好，并獲得優(yōu)化工藝的條件為提取溫度38℃、液料比19∶1mL/g、提取時(shí)間95min。在此工藝條件下，花色苷提取效果A525為12.752，與理論預(yù)測(cè)值12.876相差0.124。由此可以看出，采用酸性乙醇作為提取溶劑，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，能夠更好地提取紫茄皮中的花色苷。

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Optimization of anthocyanins extraction conditions of purple eggplant-peel by response surface methodology

GUO Fei，LIU Ji，HUANG Peng，LIU Dong-jie，XIONG Ya-bo，QIN Wen*
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

Using purple eggplant-peel as the research object，organic solvent extraction as the method，with the anthocyanin solution absorbance as a measure indicator.Response surface analysis method was used to optimize the extraction condition of purple eggplant-peel anthocyanins.On the basis of single factor experiments，extraction temperature，liquid-solid ratio（mL/g）and extraction time were chosen as arguments and A525V/m（V：extracting agent，m：the sample quality）as response value.The interaction of the respective variables and their influence on the extraction rate were studied by using Box-Benhnken central composite design and response surface analysis theory.Under the condition of 70%ethanol（containing 0.05%hydrochloric acid，V/V），the optimum extraction condition for extraction was obtained.Results showed that optimum conditions were：the temperature was 38℃，liquid-solid ratio was 19∶1，extraction time was 95min.Under these conditions，A525，the effect of anthocyanins extraction was 12.752.Comparing with the theoretical value 12.876，the relative error was 0.124.Results indicated that the equation derived by response regression equation had some practical significance.

purple eggplant-peel；anthocyanins；extraction；response surface method

TS255.1

B

1002－0306（2014）06－0268－06

2013－07－30 *通訊聯(lián)系人

郭菲（1987－），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。