Annexin5、ET－1、vWF在子癇前期患者胎盤中的表達(dá)

任春麗，唐興國，任 磊

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科；2.承德職業(yè)護(hù)理學(xué)院解剖教研室；3.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，河北承德067000）

Annexin5、ET－1、vWF在子癇前期患者胎盤中的表達(dá)

任春麗1，唐興國2，任 磊3

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科；2.承德職業(yè)護(hù)理學(xué)院解剖教研室；3.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，河北承德067000）

目的 研究子癇前期患者胎盤中Annexin5、ET－1、vWF的表達(dá)水平，并探討子癇前期發(fā)病機(jī)制。方法 采用免疫組化方法檢測子癇前期患者84例（輕度29例、早發(fā)重度型27例、晚發(fā)重度型28例）及對照組29例胎盤組織中Annexin5、ET－1、vWF的表達(dá)水平。結(jié)果 ①胎盤中Annexin 5在子癇前期各組表達(dá)強(qiáng)度明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。雖表達(dá)強(qiáng)度早發(fā)型＜晚發(fā)型＜輕度組，但各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。②胎盤中ET－1在子癇前期各組表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而子癇前期患者各組間隨病情的加重ET－1水平呈上升趨勢，早發(fā)型＞晚發(fā)型＞輕度子癇前期患者，差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。③胎盤vWF在癇前期各組中表達(dá)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；重度子癇前期組（早發(fā)型與晚發(fā)型）顯著高于輕度子癇前期組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；而早發(fā)型重度子癇前期組與晚發(fā)型重度子癇前期組比較，雖早發(fā)型胎盤組織vWF的表達(dá)雖有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 胎盤中Annexin 5、ET－1、vWF的表達(dá)可能與子癇前期發(fā)病機(jī)制有關(guān)，通過影響胎盤中凝血－纖溶系統(tǒng)及血管內(nèi)皮系統(tǒng)，參與子癇前期發(fā)生、發(fā)展的病理生理過程。

子癇前期；Annexin 5；ET－1；vWF；免疫組化

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1141）

子癇前期（Preeclampsia，PE）是妊娠期特有的疾病，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒發(fā)病率及死亡率升高的主要原因。目前子癇前期的病因尚不明確。研究表明子癇前期基本病理生理變化是全身小血管痙攣，內(nèi)皮損傷及局部缺血。全身各系統(tǒng)各臟器灌流減少，導(dǎo)致各系統(tǒng)嚴(yán)重受損，對母兒造成危害，甚至導(dǎo)致母兒死亡［1］。膜聯(lián)蛋白5（annexin5）被認(rèn)為通過凝血系統(tǒng)和抗凝血系統(tǒng)的失衡致胎盤缺血缺氧相關(guān)，而血管性假血友病性因子（von Willbrand Factor，vWF）和內(nèi)皮素1（ET－l）是血管內(nèi)皮損傷重要的標(biāo)記物。本研究通過免疫組化方法檢測子癇前期患者胎盤中Annexin5、ET－1、vWF表達(dá)，探討An－nexin5、ET－1、vWF與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料來源

選取2010年10月—2011年10月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院的患者113例，其中子癇前期患者84例，分為輕度子癇前期組（mPE）、早發(fā)型重度子癇前期組（EOSP）、晚發(fā)型重度子癇前期組（LOSP）。mPE患者29例，年齡（28.17±3.73）歲，孕周（37.76±1.07）周；EOSP患者27例，年齡（29.41±5.59）歲，孕周（30.99±1.36）周；LOSP患者28例，年齡（29.00±4.24）歲，孕周（36.53± 1.35）周；另選取無內(nèi)外科合并癥，因產(chǎn)科和社會因素行剖宮產(chǎn)者的健康孕婦組為對照組29例，年齡（28.72±4.69）歲，孕周（39.31±0.74）周。子癇前期各組患者年齡與健康孕婦組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；子癇前期各組患者孕周與健康孕婦組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照謝幸，茍文麗主編《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版診斷標(biāo)準(zhǔn)。早發(fā)型子癇前期孕周界定為32周。各組孕婦均為單胎妊娠，既往無心臟病、糖尿病、慢性高血壓、肝腎疾病病史。分娩方式均為硬膜外阻滯麻醉下剖宮產(chǎn)分娩。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 所有患者剖宮產(chǎn)術(shù)中胎盤娩出后立即取靠近臍帶的母面胎盤組織4×3 cm，用無菌生理鹽水漂洗，去除血液并吸干水份，標(biāo)本立即置入4%多聚甲醛溶液中固定3天，石蠟包埋備免疫組化用。

1.2.2 檢測方法 采用免疫組化方法。試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。免疫組織化學(xué)按試劑盒方法嚴(yán)格操作。操作步驟：①石蠟包埋連續(xù)切片4μm貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的玻片上，80℃烘烤50min；②石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟及100%、95%、90%、80%的梯度酒精脫水；③3%H2O2孵育10min（室溫）封閉滅活內(nèi)源性過氧化酶；④PBS沖洗5min，把切片放入0.01mol／L（pH6.0）枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行微波爐抗原修復(fù)10min；⑤加正常山羊血清工作液進(jìn)行封閉，在37℃濕盒中溫育60min；⑥滴加適當(dāng)濃度－抗，37℃濕盒中溫育60min后，在濕盒中4℃過夜；⑦PBS洗3×5min，滴加酶標(biāo)羊抗鼠／兔IgG聚合物即二抗，室溫孵育15min，緊接著PBS洗3 ×5min；⑧DAB顯色：取1ml蒸餾水加試劑盒中A、B、C試劑各－滴，室溫顯色；⑨蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染核，封片，觀察。⑩以PBS代替ATl抗體作為陰性對照。

1.2.3 結(jié)果判定 在400倍視野下，隨機(jī)選取5個視野，結(jié)果根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)來判斷。根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度計分：細(xì)胞內(nèi)可見大量棕色顆粒為3分，可見較深棕色顆粒為2分，可見淡黃色顆粒為1分，無著色或與背景－致為0分。隨機(jī)觀察5個HP，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，得出陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計分：≥51%為3分，26%－50%為2分，1%－25%為1分，無陽性細(xì)胞為0分。兩種計分方法相加，5－6分為強(qiáng)陽性（＋＋＋），3－4分為陽性（＋＋），2分為弱陽性（＋），0－1分為陰性（－）。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用spss19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理，組間計數(shù)資料采用χ2檢驗和Fisher’s精確概率法，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組胎盤組織中Annexin5、ET－1、vWF表達(dá)水平

2 結(jié)果

2.1 胎盤組織中Annexin 5的定位及表達(dá)水平

子癇前期各組與對照組胎盤中Annexin 5的主要表達(dá)部位為血管內(nèi)皮細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞的胞膜、胞漿，而在間質(zhì)細(xì)胞胞膜、胞漿呈散在表達(dá)；子癇前期各組表達(dá)呈弱陽性或陰性，表現(xiàn)為胞膜、胞漿染色呈淺棕色或淺黃色，甚至不染色；而在健康對照組表達(dá)呈陽性或強(qiáng)陽性，主要表現(xiàn)為胞膜增厚，胞膜、胞漿染色呈棕褐、棕黃或淺黃色。見圖1。子癇前期各組與對照組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。雖表達(dá)強(qiáng)度早發(fā)型＜晚發(fā)型＜輕度組，但各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 胎盤組織中ET－1的定位及表達(dá)水平

子癇前期各組與正常妊娠組胎盤ET－1在血管內(nèi)皮細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛間質(zhì)均有表達(dá)。子癇前期各組胎盤ET－1與正常妊娠組比較，在胎盤中的表達(dá)部位－致，但子癇前期各組表達(dá)程度明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。而子癇前期患者各組間隨病情的加重ET－1水平呈上升趨勢，早發(fā)型重度子癇前期患者ET－1水平高于晚發(fā)型重度子癇前期患者，而晚發(fā)型重度子癇前期患者ET－1水平明顯高于輕度子癇前期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 胎盤組織中vWF的定位及表達(dá)水平

子癇前期各組與正常妊娠組胎盤vWF在滋養(yǎng)細(xì)胞及間質(zhì)中均有陽性表達(dá)，主要集中在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中，少量表達(dá)于絨毛間質(zhì)中。子癇前期各組與對照組比較，胎盤組織vWF的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。重度組（早發(fā)型與晚發(fā)型）子癇前期胎盤組織vWF的表達(dá)顯著高于輕度子癇前期組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；而早發(fā)型重度子癇前期組與晚發(fā)型重度子癇前期組比較，早發(fā)型胎盤組織vWF的表達(dá)雖有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖1 Annexin5在各組胎盤中的表達(dá)（SP×400）

圖2 ET－1在各組胎盤組織中的表達(dá)（SP×400）

圖3 vWF在各組胎盤組織中的表達(dá)（SP×400）

3 討論

3.1 Annexin 5與子癇前期

Annexin 5是研究最早、在人體內(nèi)分布最廣的膜聯(lián)蛋白之－，廣泛存在于機(jī)體的各種組織細(xì)胞中，位于人類4號染色體q26－q28，含28kbDNA，具有廣泛和重要的生物學(xué)功能，其中抗凝作用是其重要功能。在胎盤中Annexin 5存在于合體滋養(yǎng)細(xì)胞層的頂端，是－種抗凝蛋白，正常孕婦中在對暴露于活化血小板表面的磷脂酰絲氨酸具有高親和性而達(dá)到抗凝作用。在子癇前期患者中Annexin 5表達(dá)下降導(dǎo)致抗凝－纖溶系統(tǒng)失衡而出現(xiàn)高凝狀態(tài)，引起胎盤子宮螺旋小動脈形成微血栓導(dǎo)致胎盤組織缺血缺氧，從而引發(fā)子癇前期、胎盤供血不足、胎兒宮內(nèi)生長遲緩［2］。近來研究發(fā)現(xiàn)，annexin 5基因上的M2基因型亦是－個與子癇前期的風(fēng)險因子。研究發(fā)現(xiàn)［2］AnnexinV基因中M2突變會降低Annexin 5基因啟動子的啟動活性，導(dǎo)致Annexin 5表達(dá)減少。S.Ota［3］等研究胎兒Annexin 5基因顯示突變M2基因型是減少Annexin 5的啟動基因，突變M2基因型無論來自父方還是來自母方，都是發(fā)生子癇前期的基本的決定因素。攜帶M2基因的婦女發(fā)生妊娠期高血壓疾病的幾率是未攜帶者的兩倍，進(jìn)－步說明Annexin 5表達(dá)不足很可能是造成子癇前期發(fā)生的原因之一。Fang Shu［4］等用免疫組化方法檢測胎盤Annexin 5水平，表明子癇前期患者胎盤Annexin 5表達(dá)下降可能導(dǎo)致胎盤絨毛間高凝狀態(tài)，從而導(dǎo)致胎兒生長受限。Xin H［5］等研究表明子癇前期各組較對照組胎盤中AnnexinV表達(dá)水平下降，但子癇前期各組間表達(dá)未見明顯差異，這些與本研究相符。

3.2 ET－1與子癇前期

子癇前期發(fā)病與子宮螺旋小動脈痙攣減少供給及胎盤灌流不足有關(guān)。而ET－1ET1是血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的強(qiáng)大的縮血管物質(zhì)，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的內(nèi)源性縮血管肽，通常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞合成少量的ET－1，通過自分泌或旁分泌作用于血管平滑肌細(xì)胞，引起血管收縮［6］。通過ETA、ETB受體對子宮螺旋動脈和胎盤血管進(jìn)行調(diào)節(jié)［7］。正常孕婦血漿中ET－1的濃度約為5－10pg／ml，不足以收縮血管，而在子癇前期孕婦血漿ET－1的濃度為20－50pg／ml，促進(jìn)螺旋小動脈痙攣，導(dǎo)致子癇前期發(fā)生，同時胎盤組織缺血、缺氧出現(xiàn)胎兒宮內(nèi)生長受限［8］。Zhao XL［9］等研究表明ET－1在子癇前期患者血漿、臍血及胎盤中均高表達(dá)。本研究顯示子癇前期患者各組間隨病情的加重ET－1水平呈上升趨勢，且早發(fā)型高于晚發(fā)型。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.3 vWF與子癇前期

血管性假血友病因子（vonWillebrandfactor vWF）是反映血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷敏感性指標(biāo)，vwF是外源性凝血系統(tǒng)啟動的因子［10］。vWF來源于內(nèi)皮細(xì)胞，且又貯存于內(nèi)皮細(xì)胞之中，當(dāng)內(nèi)皮受損時，vWF釋放入血，血漿中的vWF的量就增加，分泌到血漿或血管內(nèi)皮下的vWF作為分子橋配體參與血小板黏附、聚集，并直接參與血栓形成。己經(jīng)證實，正常孕婦血漿中vWF含量較非孕婦女升高，雖著妊娠周數(shù)增加有逐漸增加趨勢，這屬于保護(hù)性生理機(jī)制，有利于胎盤剝離后的止血。而在子癇前期患者中處于異常高表達(dá)，現(xiàn)國外研究也表明，妊娠期高血壓疾病患者臨床表現(xiàn)剛－出現(xiàn)，就已測得其血漿中vWF水平升高，最早可在孕24周時測出［11］。Mauro Parra－Cordero等［12］研究表明子癇前期患者血漿中vWF水平明顯升高，這種升高是因為胎盤缺血缺氧導(dǎo)致胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷vWF釋放入血漿內(nèi)增加。胎盤免疫組化顯示vWF在胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)減少，但在絨毛間隙表達(dá)增多。本研究顯示，子癇前期患者中vWF表達(dá)明顯高于健康孕婦組，且病情越重，vWF表達(dá)水平越高。

綜上所述，子癇前期患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)及凝血－纖溶系統(tǒng)失衡，子宮胎盤床螺旋小動脈形成障礙以及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞植入子宮內(nèi)膜過淺，導(dǎo)致胎盤組織缺血、缺氧，通過生成多種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)，使其進(jìn)入孕婦母體血液循環(huán)引起廣泛的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使ET1、vWF等縮血管因子的合成和釋放增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能失衡，從而引起全身小動脈痙攣及胎盤灌流不足，導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。通過研究胎盤中Annexin 5、ET－1、vWF的表達(dá)，探究子癇前期發(fā)病機(jī)制，旨對子癇前期的早期診斷及治療有－定臨床價值。

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Expression of Annexin5，Endothelin－1，von Willebrand factor in Placenta with Preeclampsia

REN Chun－li，TANG Xinguo，REN Lei.
（Department of Obstetrics，the Affiliated Hospital of Chengde Medical University，Chengde Hebei 067000，China）

Objective To investigate the expression of Annexin 5，Endothelin－1and von Willebrand factor in the placenta，and to explore the mechanism of preeclampsia.Methods Expression of Annexin 5，Endothelin－1and von Willebrand factor was detected by immunohistochemistry in the placenta of 84women with preeclampsia including 29cases of mild preeclampsia，27cases of early－onset severe preeclampsia，28cases of late－onset severe preeclampsia and control group（29cases），respectively.Results ①The expression of annexin 5in the placenta decreased significant with preeclampsia compare to control group（P＜0.05）.Although，early－onset severe group lower late－onset severe group lower mild preclampsia，without significant difference（P＞0.05）.②The expression of endothelin－1in the placenta increased significant with preeclampsia compare to control group（P＜0.05）.With the patient＇s condition aggravating，the expression of endothelin－1increasing，early－onset severe group higher late－onset severe group higher mild preclampsia，with significant difference（P＜0.05）.③The expression of von Willebrand factor in the placenta increased significant with preeclampsia compare to control group（P＜0.05）.Severe preeclampsia including early－onset severe group and late－onset group were higher significant than mild preeclampsia（P＜0.01，P＜0.05）.Although，early－onset severe group higher late－onset severe group，without significant difference（P＞0.05）.Conclusion Annexin 5，Endothelin－1and von Willebrand factor in the placenta may play an important role in the pathogenesis of preeclampsia by affecting coagulation and blood vessel endothelium system.

Preeclampsia；Annexin 5；Endothelin－1；von Willebrand factor；immunohistochemistry

R714.24＋4

A

2013－06－20）

1007－4287（2014）07－1141－04