組織型激肽釋放酶對大鼠急性腦缺血后GLUT－1表達的影響

韓雪梅，李妮妮，李 麗，田弘極，劉松巖＊，武利濤

（1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，吉林長春130033；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院）

組織型激肽釋放酶對大鼠急性腦缺血后GLUT－1表達的影響

韓雪梅1，李妮妮1，李 麗1，田弘極1，劉松巖1＊，武利濤2

（1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，吉林長春130033；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院）

激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)（kallikre in－kinin system，KKS）在人體分布廣泛，發(fā)揮重要生理的作用，尤其在血管再生方面發(fā)揮重要作用［1］。本研究通過觀察組織型激肽釋放酶（TK）對腦缺血后GLUT－1蛋白表達的影響，并進一步探討TK作為腦保護劑對急性腦缺血的治療作用，從而為超過溶栓治療時間窗的腦梗死提供新的治療措施，為臨床腦血管病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

選擇健康雄性的Wista大鼠30只，體重250－270g，鼠齡3－5個月，由長春市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)實驗動物中心提供。實驗動物隨機分為3組，每組10只。假手術(shù)組：只暴露，不插線阻塞大腦中動脈；鹽水組（NS組）：大腦中動脈持續(xù)永久缺血（PMCAO）后給予生理鹽水，劑量：2ml·kg－1·d－1。治療組（TK組）：大腦中動脈永久缺血并注射TK，劑量：17.5×10 3U·kg－1·d－1。給藥方法：在大鼠腦缺血后8h NS、TK腹腔注射給藥，連續(xù)3d。大鼠大腦中動脈永久性缺血模型參照Longa等［2］報道的方法。

1.2 免疫組化

CLUT－1為天津生物試劑公司產(chǎn)品。免疫組化染色采用SP法。試劑盒為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品。

1.3 統(tǒng)計學分析

細胞計數(shù)，以單個標本為單位，選取腦內(nèi)3個區(qū)域（缺血周邊區(qū)、中心區(qū)和對側(cè)大腦半球），每個區(qū)域選取3個200×鏡下視野，進行計數(shù)，取平均值，結(jié)果以x—±s表示，各組間比較用方差分析，所有統(tǒng)計學處理應用SPSS統(tǒng)計軟件。

2 結(jié)果

免疫組化顯示：正常對照組無GLUT－1蛋白陽性表達。NS對照組（PMCAO）GLUT－1表達增強。陽性細胞表現(xiàn)為細胞漿呈棕黃色。在皮層、底節(jié)的神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細胞都有GLUT－1陽性表達。隨著缺血時間的延長，中心區(qū)表達逐漸下降，而周邊區(qū)陽性細胞數(shù)增多，表達呈逐漸上升趨勢，缺血3d，GLUT－1在缺血周邊區(qū)神經(jīng)細胞的表達達高峰，同時中心區(qū)神經(jīng)細胞接近正常水平，見圖1。TK治療組：GLUT－1在周邊區(qū)的神經(jīng)細胞和血管內(nèi)皮細胞的表達都顯著增強，與NS對照組相比差異顯著，P＜0.05，見表1、圖2。

在血管內(nèi)皮細胞，隨缺血時間的延長，無論在缺血中心區(qū)還是周邊區(qū)，GLUT－1的表達均逐漸增強，陽性血管數(shù)增多，血管內(nèi)皮細胞增生，缺血3d達高峰，見表2、圖3。

表1 TK對GLUT－1在缺血周邊區(qū)表達的影響（ˉx±s，n＝10）

表2 GLUT－1在血管內(nèi)皮細胞的表達（n＝10，ˉx±s）

3 討論

腦缺血后的神經(jīng)、血管調(diào)節(jié)機制尚不完全明確。多個研究表明激肽釋放酶（KKS）在腦缺血時促進神經(jīng)功能的恢復。它能夠擴血管改善循環(huán)，促進血管新生，加強神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的再生［3］，研究顯示KKS通過激肽受體降低血壓，神經(jīng)保護［4，5］。倪耀輝等［6］研究激肽釋放酶在腦缺血后延遲給藥能增加缺血區(qū)NSE陽性細胞，從而證明其腦保護作用。血管再生在腦組織發(fā)生缺血后誘發(fā)。GLUT－1作為低氧誘導因子－1（HIF－1）的靶基因同樣可以通過促進血管生成、改善缺血區(qū)周圍的血流供應、改善腦內(nèi)葡萄糖代謝從而促進腦組織重建。

本研究顯示：正常對照組無GLUT－1蛋白陽性表達，NS對照組（PMCAO）顯示GLUT－1表達增加，證明了缺血可以誘導GLUT－1的表達，至缺血后3d，周邊區(qū)的GLUT－1表達達高峰。TK組可見GLUT－1在周邊區(qū)表達上調(diào)，而且表達GLUT－1的神經(jīng)細胞多為存活的神經(jīng)元。表明TK能夠促進GLUT－1的表達。因此GLUT－1在腦缺血及TK治療后表達增加是神經(jīng)元的代償性反應，有助于恢復腦的葡萄糖和氧代謝和穩(wěn)定神經(jīng)元細胞膜。

圖1 缺血3 d交界區(qū)GLUT－1（組化200×）

圖2 TK治療組3 d周邊區(qū)GLUT－1（組化200×）

圖3 TK治療后GLUT－1在血管內(nèi)皮細胞高表達（組化200×）

GLUT－1在血管成分的表達同樣非常明顯。隨缺血時間的延長，無論在中心區(qū)還是周邊區(qū)，GLUT－1在血管內(nèi)皮細胞中的表達逐漸增強，陽性血管數(shù)增多，伴有微血管增生。TK治療組GLUT－1在血管內(nèi)皮表達顯著增強，與鹽水對照組相比P＜0.05。缺血后，局部血流量急劇減少，腦組織發(fā)生代償性反應，葡萄糖載體蛋白的數(shù)目增多，腦血流增加，使腦對糖的利用保持在正常水平［7］。同時GLUT－1重新分布在血管內(nèi)皮細胞，血管腔內(nèi)面的GLUT－1數(shù)量增多，使腦葡萄糖代謝維持，轉(zhuǎn)運增加［8，9］。GLUT－1在血管成分的高表達是機體對缺血缺氧后一種防御反應，能夠向缺血腦組織提供更多的葡萄糖，以維持腦的能量代謝［10］。

激肽釋放酶能夠促進多種血管生長因子及肝細胞性生長因子（HGF）的生成和釋放［11］。本實驗顯示：TK治療組缺血周邊區(qū)新生血管增多，GLUT－1在血管內(nèi)皮細胞中表達數(shù)量及強度均增強，表明TK可以促進血管生成，并與通過上調(diào)GLUT－1的表達有關(guān)。

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2013－10－16）

1007－4287（2014）07－1052－02

吉林省科技廳社會發(fā)展計劃項目（No.20090463）

＊通訊作者