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    沉默VEGF基因?qū)ο贅幽倚园┘毎忠u的影響

    2014-05-06 02:35:29黃燕婷勞均平
    中國醫(yī)學創(chuàng)新 2014年12期
    關(guān)鍵詞:侵襲血管內(nèi)皮生長因子

    黃燕婷 勞均平

    【摘要】 目的:利用RNAi技術(shù)沉默腺樣囊性癌細胞株ACC-2中VEGF的表達,探討其對腫瘤細胞侵襲能力的影響。方法:利用RNAi技術(shù)沉默VEGF表達,用Transwell侵襲實驗檢測細胞體外侵襲能力的變化。結(jié)果:與對照組比較,VEGF的siRNA能有效地抑制實驗組ACC-2細胞的侵襲能力。結(jié)論:沉默VEGF減弱腺樣囊性癌的侵襲能力。

    【關(guān)鍵詞】 涎腺腺樣囊性癌; 血管內(nèi)皮生長因子; RNA干擾; 侵襲

    The Study of the Influence on Invasiveness Activity of ACC-2 Cells Via RNAi VEGF/HUANG Yan-ting,LAO Jun-ping.//Medical Innovation of China,2014,11(12):037-038

    【Abstract】 Objective:To investigate the inhibitory effects of VEGF targeted small interference RNA(siRNA) on invasiveness of salivary adenoid cystic carcinoma(SACC) cell line ACC-2. Method: VEGFsiRNA was transfect into SACC cell line ACC-2 and then examine the changes of invasive ability of ACC-M. Result: The invasive and proliferative abilities of ACC-2 decreased, and the difference between the two groups were statistically significant(P<0.05). Conclusion:Si-VEGF can effectively decrease invasiveness of SACC cells.

    【Key words】 Salivary adenoid cystic carcinoma; Vasculare endothelial growth factor; RNA interference; Invasiveness

    First-authors address:The First Peoples Hospital of Foshan City,F(xiàn)oshan 528000,China

    doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.013

    涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一,約占口腔惡性腫瘤的六分之一。腺樣囊性癌具有嗜神經(jīng)侵襲以及跳躍性轉(zhuǎn)移的特點。手術(shù)預(yù)后差,侵襲以及轉(zhuǎn)移是患者的主要病因之一[1-2]。

    血管內(nèi)皮生長因子(vasculare endothelial growth factor,VEGF)是一種強烈誘導(dǎo)血管生成的細胞因子,在腎癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌以及胚胎組織性腫瘤中多有報道。腫瘤組織中VEGF表達水平與惡性程度成正相關(guān),并明顯高于非腫瘤組織[3-4]。這表明VEGF可能通過促進血管形成等方式促進腫瘤的生長,尤其在高度血管化的腫瘤中。VEGF及其受體是血管生成的關(guān)鍵因子,其過度表達與腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[5]。

    1 資料與方法

    1.1 細胞培養(yǎng) 腺樣囊性癌細胞系低轉(zhuǎn)移株(ACC-2)由中山大學附屬孫逸仙醫(yī)院李勁松教授饋贈。兩株細胞培養(yǎng)于10%的FBS、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液,置于37 ℃,5%(v/v)CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2 siRNA的設(shè)計和轉(zhuǎn)染 VEGF特異性干擾片段參照之前文獻設(shè)計。片段序列為:GGCGTCGCACTGAAACTTT,由吉瑪生物合成。

    1.3 mRNA的提取和檢測 細胞株的mRNA的提取和cDNA的合成。TRIzol法提取細胞株中總的RNA,cDNA的合成采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)。VEGF引物的設(shè)計如下:VEGF基因:上游引物:5-GATCCTGCCCTGTCTCTCTG-3;下游引物:5-GACTCGCCCTCATCCTCTT-3。內(nèi)參GAPDH基因:上游引物:5-GCCTCAAGATCATCAGCAATGC-3;下游引物:5-CATGGACTGTGGTCATGAGTCTT-3。

    1.4 Western Blot檢測VEGF蛋白的表達 分別收集轉(zhuǎn)染48 h后的ACC-2細胞,用預(yù)冷的PBS洗滌,加入蛋白裂解液,提取總蛋白。分別取50 μg蛋白,97 ℃變性后,經(jīng)10% SDS-PAGE分離,將凝膠置于轉(zhuǎn)移平衡緩沖液中,再以200 V行電泳跑膠,時間1 h。再以25 V電壓1.5 h將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;5%脫脂牛奶(TBST溶解)封閉1 h;10%FBS/TBST加一抗4 ℃孵育過夜;漂洗TBST 3次,

    10 min/次;10%FBS/TBST加二抗室溫下孵育1 h,漂洗TBST 3次,10 min/次。取等量的ECL發(fā)光試劑A、B液,混勻后,孵育硝酸纖維素膜,曝光,以GAPDH為內(nèi)參。

    1.5 Transwell實驗 細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,以無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,“饑餓”12 h。消化細胞,終止消化后離心棄去培養(yǎng)液,用PBS洗1~2遍,用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸細胞,調(diào)整細胞密度至5×105個/mL單細胞懸液。取細胞懸液100 ?L加入Transwell小室,設(shè)3個復(fù)孔。24孔板下室加入450 ?L含10%FBS的細胞培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)48 h,用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞。采用0.1%結(jié)晶紫染色。選擇相同位置的3個視野進行計數(shù)。

    1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料用(x±s)表示,比較采用t檢驗,計數(shù)資料采用 字2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 檢測結(jié)果 ACC-2胞中VEGF基因的qPCR以及蛋白產(chǎn)物在轉(zhuǎn)染后,實驗組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。

    3 討論

    血管內(nèi)皮生長因子(vasculare endothelial growth factor,VEGF)是一種強烈誘導(dǎo)血管生成的細胞因子,VEGF的表達廣泛見于腫瘤及非腫瘤的病理過程中,它的表達與轉(zhuǎn)化生長因子B(TGF-β)、血小板源性生長因子(PDGF)、NO以及一些重金屬離子有關(guān),還受缺血和缺氧環(huán)境的調(diào)節(jié)[6]。腫瘤組織中VEGF表達水平與惡性程度成正相關(guān),并明顯高于非腫瘤組織[7]。這表明VEGF可能通過促進血管形成等方式促進腫瘤的生長,尤其在高度血管化的腫瘤中[8-10]。VEGF及其受體是血管生成的關(guān)鍵因子,其過度表達能從多方面影響腫瘤的脈管生成,加速腫瘤轉(zhuǎn)移,與腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[11-12]。本研究通過沉默VEGF基因從而降低ACC-2的侵襲能力。揭示了VEGF的對ACC-2侵襲的調(diào)控能力,但針對ACC-2侵襲的調(diào)控的具體信號通路還需要做進一步的研究。并且需要做動物實驗驗證,希望以后可以為以VEGF為靶點的惡性腫瘤的生物治療提供理論的依據(jù)。

    參考文獻

    [1] Tian Z, Li L, Wang L, et al. Salivary gland neoplasms in oral and maxillofacial regions: a 23-year retrospective study of 6982 cases in an eastern Chinese population[J]. Int J Oral Maxillofac Surg,2010, 39(10):235-242.

    [2]勞均平,梁軍,歐陽可雄.RNA干擾iNOS基因?qū)ο贅幽倚园┘毎鲋郴钚缘挠绊慬J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2013,27(273):6-8.

    [3] Kourembanas S, Mcquillan L P, Leung G K, et al. Nitric oxide regulated the expression of vasoconstrictors and growth factor by vascular endothelium under both normoxia and hypoxia[J]. J Clin Invest, 1993, 92(5):99-104.

    [4] Assal O N, Yamanoi A, Soda Y, et al. Clinical significance of microvessle density and vascular endothelial growth factor expretion in hepatocellular carcinoma and surrounding liver: possible involvement of vascular endothelial growth factor in the angiogenesis of cirrhotic liver[J]. Hepatology, 1998, 27(5):1554-1562.

    [5] Lee J C, Chow N H, Wang S T, et a1.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in eolorectal cancer patients[J].Eur J Cancer,2000,36(6):748-753.

    [6] Jiang B H, Semenza G L, Bauer C, et al. Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over s physiologically relevant range of O2 tension[J]. Am J Physiol, 1996, 271(7): 1172-1182.

    [7] Mise M, Arii S, Higashituji H, et al. Clinical significance of vascular endothelial growth factor gene expression in liver tumor[J]. Hepatology, 1996, 23(10): 455-464.

    [8] Hatva E, Bohling T, Jaaskelainen J, et al. Vascular growth factors and receptors in capillary hemangioblastomas and hemangiopericytomas[J]. Am J Pathol, 1996, 148(7): 763-775.

    [9] Cornali E, Zietz C, Benelli R, et al. Vascular endothelial growth factor regulate angiogenesis and vascular permeability in Kaposi's sarcoma[J]. Am J Pathol, 1996, 149(8): 1851-1869.

    [10]宋洪生,吳芳.外源性p21waf1基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細胞系BGC-823增殖的影響[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2013,10(1):3-5.

    [11]史玉嶺.夾心ELISA檢測血清結(jié)締組織生長因子及其初步臨床應(yīng)用[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2011,8(30):9-11.

    [12]羅偉,冀林華,李占全,等.急性白血病患者血漿VEGF測定及其臨床意義[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2013,10(14):70-71.

    (收稿日期:2014-02-17) (本文編輯:黃新珍)

    1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料用(x±s)表示,比較采用t檢驗,計數(shù)資料采用 字2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 檢測結(jié)果 ACC-2胞中VEGF基因的qPCR以及蛋白產(chǎn)物在轉(zhuǎn)染后,實驗組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。

    3 討論

    血管內(nèi)皮生長因子(vasculare endothelial growth factor,VEGF)是一種強烈誘導(dǎo)血管生成的細胞因子,VEGF的表達廣泛見于腫瘤及非腫瘤的病理過程中,它的表達與轉(zhuǎn)化生長因子B(TGF-β)、血小板源性生長因子(PDGF)、NO以及一些重金屬離子有關(guān),還受缺血和缺氧環(huán)境的調(diào)節(jié)[6]。腫瘤組織中VEGF表達水平與惡性程度成正相關(guān),并明顯高于非腫瘤組織[7]。這表明VEGF可能通過促進血管形成等方式促進腫瘤的生長,尤其在高度血管化的腫瘤中[8-10]。VEGF及其受體是血管生成的關(guān)鍵因子,其過度表達能從多方面影響腫瘤的脈管生成,加速腫瘤轉(zhuǎn)移,與腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[11-12]。本研究通過沉默VEGF基因從而降低ACC-2的侵襲能力。揭示了VEGF的對ACC-2侵襲的調(diào)控能力,但針對ACC-2侵襲的調(diào)控的具體信號通路還需要做進一步的研究。并且需要做動物實驗驗證,希望以后可以為以VEGF為靶點的惡性腫瘤的生物治療提供理論的依據(jù)。

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    [2]勞均平,梁軍,歐陽可雄.RNA干擾iNOS基因?qū)ο贅幽倚园┘毎鲋郴钚缘挠绊慬J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2013,27(273):6-8.

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    [6] Jiang B H, Semenza G L, Bauer C, et al. Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over s physiologically relevant range of O2 tension[J]. Am J Physiol, 1996, 271(7): 1172-1182.

    [7] Mise M, Arii S, Higashituji H, et al. Clinical significance of vascular endothelial growth factor gene expression in liver tumor[J]. Hepatology, 1996, 23(10): 455-464.

    [8] Hatva E, Bohling T, Jaaskelainen J, et al. Vascular growth factors and receptors in capillary hemangioblastomas and hemangiopericytomas[J]. Am J Pathol, 1996, 148(7): 763-775.

    [9] Cornali E, Zietz C, Benelli R, et al. Vascular endothelial growth factor regulate angiogenesis and vascular permeability in Kaposi's sarcoma[J]. Am J Pathol, 1996, 149(8): 1851-1869.

    [10]宋洪生,吳芳.外源性p21waf1基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細胞系BGC-823增殖的影響[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2013,10(1):3-5.

    [11]史玉嶺.夾心ELISA檢測血清結(jié)締組織生長因子及其初步臨床應(yīng)用[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2011,8(30):9-11.

    [12]羅偉,冀林華,李占全,等.急性白血病患者血漿VEGF測定及其臨床意義[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2013,10(14):70-71.

    (收稿日期:2014-02-17) (本文編輯:黃新珍)

    1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料用(x±s)表示,比較采用t檢驗,計數(shù)資料采用 字2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 檢測結(jié)果 ACC-2胞中VEGF基因的qPCR以及蛋白產(chǎn)物在轉(zhuǎn)染后,實驗組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。

    3 討論

    血管內(nèi)皮生長因子(vasculare endothelial growth factor,VEGF)是一種強烈誘導(dǎo)血管生成的細胞因子,VEGF的表達廣泛見于腫瘤及非腫瘤的病理過程中,它的表達與轉(zhuǎn)化生長因子B(TGF-β)、血小板源性生長因子(PDGF)、NO以及一些重金屬離子有關(guān),還受缺血和缺氧環(huán)境的調(diào)節(jié)[6]。腫瘤組織中VEGF表達水平與惡性程度成正相關(guān),并明顯高于非腫瘤組織[7]。這表明VEGF可能通過促進血管形成等方式促進腫瘤的生長,尤其在高度血管化的腫瘤中[8-10]。VEGF及其受體是血管生成的關(guān)鍵因子,其過度表達能從多方面影響腫瘤的脈管生成,加速腫瘤轉(zhuǎn)移,與腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[11-12]。本研究通過沉默VEGF基因從而降低ACC-2的侵襲能力。揭示了VEGF的對ACC-2侵襲的調(diào)控能力,但針對ACC-2侵襲的調(diào)控的具體信號通路還需要做進一步的研究。并且需要做動物實驗驗證,希望以后可以為以VEGF為靶點的惡性腫瘤的生物治療提供理論的依據(jù)。

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    [4] Assal O N, Yamanoi A, Soda Y, et al. Clinical significance of microvessle density and vascular endothelial growth factor expretion in hepatocellular carcinoma and surrounding liver: possible involvement of vascular endothelial growth factor in the angiogenesis of cirrhotic liver[J]. Hepatology, 1998, 27(5):1554-1562.

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    [6] Jiang B H, Semenza G L, Bauer C, et al. Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over s physiologically relevant range of O2 tension[J]. Am J Physiol, 1996, 271(7): 1172-1182.

    [7] Mise M, Arii S, Higashituji H, et al. Clinical significance of vascular endothelial growth factor gene expression in liver tumor[J]. Hepatology, 1996, 23(10): 455-464.

    [8] Hatva E, Bohling T, Jaaskelainen J, et al. Vascular growth factors and receptors in capillary hemangioblastomas and hemangiopericytomas[J]. Am J Pathol, 1996, 148(7): 763-775.

    [9] Cornali E, Zietz C, Benelli R, et al. Vascular endothelial growth factor regulate angiogenesis and vascular permeability in Kaposi's sarcoma[J]. Am J Pathol, 1996, 149(8): 1851-1869.

    [10]宋洪生,吳芳.外源性p21waf1基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細胞系BGC-823增殖的影響[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2013,10(1):3-5.

    [11]史玉嶺.夾心ELISA檢測血清結(jié)締組織生長因子及其初步臨床應(yīng)用[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2011,8(30):9-11.

    [12]羅偉,冀林華,李占全,等.急性白血病患者血漿VEGF測定及其臨床意義[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2013,10(14):70-71.

    (收稿日期:2014-02-17) (本文編輯:黃新珍)

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