表面活性劑輔助提取首烏藤中的總黃酮

潘佳偉，閆 雨，尹 芹，楊小清，韓 偉，2

(1.華東理工大學(xué) 藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海 200237;2.上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

首烏藤，別名夜交藤，是蓼科植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥藤莖。其性甘微苦、平，具有祛風(fēng)通絡(luò)、養(yǎng)血安神等功效［1］，常用于治療失眠多夢、血虛身痛、風(fēng)濕痹痛等［2］多種病癥。目前，對于首烏藤化學(xué)成分方面的研究主要集中于其中的蒽醌類［3］(如大黃素)、茋類［4］以及黃酮類成分。

黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物，以游離態(tài)或與糖結(jié)合為苷的形式存在［5］。作為一種很強(qiáng)的抗氧化劑，它既能有效阻止細(xì)胞的退化、衰老，又可在一定程度上防止癌癥的發(fā)生。此外，還具有降低血脂，抑制炎性生物酶的滲出，增進(jìn)傷口愈合和止痛等藥理作用［6］。首烏藤莖中的黃酮組分具有清除·OH和·O－2的能力［7］。

表面活性劑分子可增加大分子有機(jī)物質(zhì)的溶解滲出能力［8］，目前已經(jīng)被初步應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取中。在中藥提取中，加入合適、適量的表面活性劑，既可以實(shí)現(xiàn)水提操作、縮短浸潤時(shí)間、提高提取效率，又能避免使用高成本的有機(jī)溶劑，減少重污染的發(fā)生［9］。

本文中筆者選取首烏藤為研究體系，采用表面活性劑輔助的方法提取首烏藤中的總黃酮，通過優(yōu)化該方法的提取工藝，以期提高首烏藤中總黃酮的得率，為后續(xù)試驗(yàn)提供理論和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要原料與試劑

首烏藤飲片(去葉)，上海華鷹藥業(yè)有限公司(批號:HY2013060303，產(chǎn)地:安徽);蘆丁對照品(批號:20130619)，上海金穗生物科技有限公司;NaNO2、NaOH和十二烷基硫酸鈉(SDS)(化學(xué)純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;Al(NO3)3(化學(xué)純)，上海新寶精細(xì)化工廠;吐溫-20、吐溫-60、吐溫-80和司班-60(化學(xué)純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;去離子水，自制。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

UV1900PC型紫外分光光度計(jì)，上海市亞研電子公司;JA31002型電子天平，上海市天平儀器廠;DF101-S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;移液管、容量瓶、量筒等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試品溶液的制備

取5.00 g首烏藤飲片置于500 mL圓底燒瓶中，按照一定的液固比加入相應(yīng)體積的去離子水，并加入一定質(zhì)量的表面活性劑，固定磁力攪拌功率，水浴加熱至一定溫度后，維持一定時(shí)間。結(jié)束后，靜置冷卻至常溫，用紗布過濾，濾液作為供試品溶液待測。

1.2.2 分析方法

參考《中國藥典》規(guī)定的黃酮含量分析方法［10］，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法進(jìn)行供試品溶液中總黃酮含量的測定。精密稱取干燥至恒質(zhì)量的蘆丁對照品10 mg，置于50 mL容量瓶內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶解并稀釋至刻度，即得蘆丁對照品溶液。將對照品溶液與供試品溶液置于紫外可見分光光度計(jì)下，于400～700nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定首烏藤總黃酮的最大吸收波長為492 nm。然后精確吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 和 8.0 mL 蘆丁對照品溶液置于25 mL容量瓶中，順序加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液1.0 mL(搖勻，放置6 min)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)3溶液1.0 mL(搖勻，放置6 min)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的NaOH溶液10.0 mL，補(bǔ)加去離子水至刻度，搖勻，靜置15 min后，以不含蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為空白，在492 nm處測定吸光度(A492)。

以吸光度(A492)對總黃酮質(zhì)量濃度(ρ)作回歸處理得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=13.025ρ+0.006 6，線性質(zhì)量濃度范圍為0.008～0.064 mg/mL;相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，表明具有良好的線性關(guān)系。通過系統(tǒng)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該分析方法精密度、重現(xiàn)性和顯色穩(wěn)定性均良好。

1.2.3 首烏藤中總黃酮含量的測定方法

取2.0 mL供試品溶液于25 mL容量瓶中，參照1.2.2在492 nm處測定吸光度，使用1.2.2中標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到總黃酮質(zhì)量濃度，按照下式計(jì)算總黃酮得率。

式中:ρ為總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL;V為溶劑量，mL;m為首烏藤的質(zhì)量，g;n為溶液稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取工藝單因素的考察

2.1.1 表面活性劑種類對總黃酮得率的影響

常用表面活性劑分為離子型和非離子型，由于結(jié)構(gòu)的不同，對于同一種物質(zhì)的提取而言，效果也有差異。選取司班-60、SDS、吐溫-20、吐溫-60和吐溫-80作為對象，考察表面活性劑種類對首烏藤中總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 表面活性劑對總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of surfactant on the yield of total flavonoids

由圖1可知:在表面活性劑質(zhì)量濃度3 g/L、液固比20 mL/g、提取溫度70℃、加熱時(shí)間0.5 h的情況下，使用SDS作為表面活性劑提取得率最高，且SDS價(jià)格低廉，因而選擇SDS作為實(shí)驗(yàn)所用的表面活性劑。

2.1.2 SDS質(zhì)量濃度對總黃酮得率的影響

圖2為考察不同的SDS質(zhì)量濃度對首烏藤總黃酮得率的影響結(jié)果。

圖2 SDS質(zhì)量濃度對總黃酮得率的影響Fig.2 Effects of SDS concentration on the yield of total flavonoids

由圖2可知:在液固比20 mL/g、提取溫度70℃、加熱時(shí)間0.5 h相同的情況下，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，SDS質(zhì)量濃度與得率存在正相關(guān)的關(guān)系。在較低質(zhì)量濃度下，由于未達(dá)到臨界膠束濃度，總黃酮得率隨SDS質(zhì)量濃度的增大而增加，達(dá)到臨界膠束濃度后，SDS在飲片表面吸附達(dá)到極值，總黃酮得率提升不再顯著，而過多的表面活性劑會造成浪費(fèi)，故選擇SDS的最佳質(zhì)量濃度為3 g/L。

2.1.3 液固比對總黃酮得率的影響

對于傳質(zhì)而言，傳質(zhì)速率的大小與傳質(zhì)推動(dòng)力的大小有關(guān)。圖3為液固比對總黃酮得率的影響關(guān)系圖。

由圖3可以看出:在選定的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著液固比的升高，總黃酮得率逐漸上升，這是因?yàn)樵黾右汗瘫饶芴岣咛崛∵^程的傳質(zhì)推動(dòng)力。當(dāng)液固比超過30 mL/g后，由于溶劑量的增大，使得加熱效果等因素受到干擾，總黃酮得率上升趨勢不明顯。同時(shí)，過高的液固比在實(shí)際的生產(chǎn)操作中會增加處理量和能耗，使生產(chǎn)效率降低。因此最終液固比為30 mL/g。

2.1.4 提取溫度對總黃酮得率的影響

溫度是微觀粒子熱運(yùn)動(dòng)的宏觀表現(xiàn)，對提取效果存在影響。通過設(shè)置提取溫度為65、70、75、80、85和90℃進(jìn)行6組實(shí)驗(yàn)，考察提取溫度對總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖3 液固比對總黃酮得率的影響Fig.3 Effects of liquid to solid ratio on the yield of total flavonoids

圖4 提取溫度對總黃酮得率的影響Fig.4 Effects of extracting temperature on the yield of total flavonoids

由圖4可知:隨著溫度的升高，總黃酮得率呈上升趨勢。在溫度為75℃時(shí)，得率增長率較低，可能是在此溫度下膠束結(jié)構(gòu)達(dá)到平衡。溫度突破75℃后，該平衡被打破，溫度的升高會成為影響得率的顯著因素，直至溫度超過85℃再次達(dá)到平衡。綜合能耗等因素，選取80℃為提取溫度。

2.1.5 加熱時(shí)間對總黃酮得率的影響

加熱時(shí)間的長短將影響表面活性劑的提取效果。時(shí)間太短會使浸潤、提取不完全，導(dǎo)致表面活性劑增溶效果減弱;而時(shí)間較長，不僅能耗增加，還會增加其他成分的溶出，增加后續(xù)純化分離的成本。圖5考察了不同加熱時(shí)間對總黃酮得率的影響。

由圖5可以看出:隨著加熱時(shí)間的延長，液固接觸時(shí)間增多，有利于傳質(zhì)的進(jìn)行，總黃酮得率上升。在2.5 h時(shí)，得率達(dá)到最大值。當(dāng)加熱時(shí)間超過2.5 h后黃酮得率呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是加熱時(shí)間過長導(dǎo)致部分黃酮分解所致，因而加熱時(shí)間選取2.5 h為宜。

圖5 加熱時(shí)間對總黃酮得率的影響Fig.5 Effects of heating time on the yield of total flavonoids

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，選取其主要影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過對試驗(yàn)結(jié)果的分析，確定首烏藤總黃酮的最佳提取工藝條件，并進(jìn)行重現(xiàn)性驗(yàn)證。

以提取溫度、加熱時(shí)間、液固比為考察因素，每個(gè)因素考察3個(gè)水平，按照正交試驗(yàn)L9(33)表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。因素水平表見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果和分析表見表2和表3。

由表3的極差數(shù)據(jù)分析可見，各因素對首烏藤總黃酮得率的影響從大到小依次為:加熱時(shí)間、提取溫度、液固比。結(jié)合單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)得到優(yōu)化工藝條件得出:SDS質(zhì)量濃度3 g/L，液固比40 mL/g，提取溫度90℃，加熱時(shí)間2.5 h。在此條件下，進(jìn)行 3次平行實(shí)驗(yàn)，總黃酮得率平均值為6.1%。對比正交試驗(yàn)結(jié)果，可見該工藝結(jié)果較好，且具有較好的穩(wěn)定性。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

表3 正交試驗(yàn)分析Table 3 Analysis of orthogonal experiments

2.3 對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果

除本實(shí)驗(yàn)方法外，常用的中藥提取方法包括:熱回流提取法、超聲協(xié)同提取法［11］、微波提取法［12］和索氏提取法。

筆者設(shè)計(jì)了對照實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表4。其中，SDS輔助提取法(Ⅱ)采取最佳工藝條件進(jìn)行;在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，一般考慮選取較小的液固比、藥渣重復(fù)提取的方法，故將 SDS輔助提取法(Ⅰ)與最佳工藝進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)總黃酮得率相差不大，故確定以30 mL/g的液固比進(jìn)行對比試驗(yàn)。

表4結(jié)果表明:表面活性劑輔助提取法得率最高，能顯著提高首烏藤總黃酮的提取效率，避免高濃度有機(jī)溶劑的使用，更加綠色環(huán)保。因此，SDS輔助提取法在提高總黃酮得率方面有較大的優(yōu)勢，是較為理想的一種提取工藝。

表4 對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Contrast experiment results

3 結(jié)論

采用表面活性劑輔助提取首烏藤中的總黃酮，考察了表面活性劑種類和濃度、提取溫度、液固比、加熱時(shí)間等因素對得率的影響，并通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝參數(shù)，結(jié)合對照實(shí)驗(yàn)，最終確定最優(yōu)工藝條件:表面活性劑SDS質(zhì)量濃度為3 g/L，液固比30 mL/g，提取溫度90℃，加熱時(shí)間2.5 h。

在最優(yōu)工藝條件下，總黃酮得率為6%。該方法具有能耗低、時(shí)間短、得率高的特點(diǎn)。

［1］ 肖揚(yáng)，段玉峰.超聲輔助提取首烏藤黃酮及其抗氧化活性的研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2009(6):38-41.

［2］ 史俊燕，肖揚(yáng).首烏藤粗提物及其不同極性黃酮組分的抗氧化活性比較［J］.食品與發(fā)酵科技，2009，45(5):35-37.

［3］ 王付榮，周洪雷.何首烏及夜交藤化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，19(5):98-100.

［4］ 緱慧君，張朝鳳，張勉，等.何首烏不同器官和組織中蒽醌和茋類化合物的分布［J］.中國野生植物資源，2008，27(2):44-48.

［5］ 曹緯國，劉志勤，邵云，等.黃酮類化合物藥理作用的研究進(jìn)展［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2003，23(12):2241-2247.

［6］ 韓偉，閆雨，潘佳偉，等.超濾在黃酮類化合物分離中的研究進(jìn)展［J］.機(jī)電信息，2012(32):7-11.

［7］ 史俊燕，段玉峰，牛富革，等.首烏藤粗提物及其不同極性黃酮組分的抗氧化活性比較［J］.食品工業(yè)科技，2009(9):112-114.

［8］ 黎彧，李善吉，吳川，等.表面活性劑協(xié)同微波提取虎杖色素的研究［J］.材料科學(xué)與工藝，2007，15(2):244-247.

［9］ 鄧修.中藥制藥工程與技術(shù)［M］.上海:華東理工大學(xué)出版社，2008.

［10］ 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典:一部［S］.2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［11］ 楊歡，閆志農(nóng)，盧曉黎，等.表面活性劑協(xié)同超聲提取花生殼中黃酮的工藝研究［J］.中國油脂，2012，37(12):57-60.

［12］ 張鵬.銀杏葉黃酮的微波提取及其抗氧化性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(12):5496-5497.