啟動子工程改造大腸桿菌K4生產(chǎn)果糖軟骨素

吳秋林，劉 佳，楊愛華，劉立明

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，無錫 214122;2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122;3.江南大學(xué) 食品微生物制造工程實驗室，無錫 214122)

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)作為糖胺聚糖類大分子酸性多糖，廣泛存在于人體組織中，被譽(yù)為人體“軟黃金”［1］。因其具有多種生理活性而作為膳食補(bǔ)充劑和保濕劑，被廣泛應(yīng)用于食品和化妝品領(lǐng)域［2－3］。硫酸軟骨素二糖單體結(jié)構(gòu)為4-GlcA-β-1，3-GalNAc-β-1(GlcA:葡 萄 糖 醛 酸，GalNAc:乙酰半乳糖胺)，根據(jù)硫酸化發(fā)生位點的不同可分為 O、A、B、C、D、E 和 F 等類型，其中，動物來源的硫酸軟骨素多為CS-A和CS-C［4］。目前，硫酸軟骨素主要來源于動物提?。?］、酶法合成［6］和微生物發(fā)酵，但由于動物提取法存在生產(chǎn)周期長而酶法合成原料成本高等缺點，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。因此，微生物發(fā)酵法已成為最具經(jīng)濟(jì)效益和開發(fā)潛力的生產(chǎn)工藝［7］。據(jù)研究，硫酸軟骨素能以莢膜多糖的形式存在于巴斯德桿菌(Pasteurella multocida)、大腸桿菌(Escherichia coli)和枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)等 微 生 物 的 細(xì) 胞 壁 中［8－10］。 雖 然，P.multocida能合成軟骨素類莢膜多糖，但是其為家禽霍亂致病菌。近年來，研究重點轉(zhuǎn)向利用來源于P.type F的軟骨素合成酶pmCS進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)軟骨素多糖鏈，但由于高昂的單糖供體成本，目前尚無量產(chǎn)報道［9，11－12］。美國 Amano Enzyme 公司篩選獲得1株可直接生產(chǎn)硫酸軟骨素的納豆枯草芽胞桿菌(B.subtilis natto)，但其產(chǎn)量僅為 0.24 g/L［10］。大腸桿菌K4(E.coli K4)能合成軟骨素類似物作為其莢膜多糖(capsular polysaccharide，K4CPS)，即果糖軟骨素(4-β-GlcA(Fru)-1，3-β-D-N-GalNAc-1)［8］，經(jīng)脫果糖和硫酸化修飾等步驟可獲得硫酸軟骨素［13］。此外，大腸桿菌具有遺傳背景清楚、莢膜多糖合成與轉(zhuǎn)運機(jī)制清晰等優(yōu)點而成為研究硫酸軟骨素發(fā)酵的主要菌株。Schiraldi等［14］采用微膜生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)大腸桿菌K4，可使K4CPS產(chǎn)量高達(dá)4.73 g/L，但比細(xì)胞得率僅為0.13 g/g(以1 g干細(xì)胞質(zhì)量中含K4CPS量計)。

目前，根據(jù)遺傳學(xué)特征、生物合成方式及其分子結(jié)構(gòu)等特性，可將大腸桿菌莢膜多糖分為4大類，即 group 1 ～group 4［15］。大腸桿菌 K4 屬于 group 2，其K4CPS合成基因簇包括 region 1、region 2和region 3 3 部分(圖1)［16］。其中 region 1 和 region 3主要參與新合成多糖鏈的修飾、轉(zhuǎn)運與定位［17］，而region 2包括kfoA～G等7個基因和1個插入序列IS2，主要編碼多糖及其前體合成相關(guān)的酶［18］。此外，group 2莢膜多糖合成基因簇的轉(zhuǎn)錄由2個σ70啟動子所調(diào)控，分別是位于region 1上游224 bp的PR1和region 3上游741 bp的PR3。PR1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生1條約8 kb的多順反子，隨后再轉(zhuǎn)錄出1條約1.3 kb的kpsS轉(zhuǎn)錄子［19］。而 PR3的轉(zhuǎn)錄可從region 3延伸至region 2，此過程需要RfaH蛋白與PR3啟動子3'端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)713 bp處ops序列的結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄過程中與RNA聚合酶復(fù)合物相互作用，調(diào)節(jié)region 2轉(zhuǎn)錄的正常進(jìn)行。ops序列的缺失或rfaH基因的突變均可減弱莢膜多糖的合成［20］。同時，UTR具有減弱PR3活性的作用，整個741 bp UTR片段的缺失可顯著提高PR3的轉(zhuǎn)錄活性［21］。因此，為了進(jìn)一步提高K4CPS產(chǎn)量，筆者通過Red同源重組技術(shù)對UTR進(jìn)行敲除，以增強(qiáng)PR3啟動子的活性，從而促進(jìn)K4CPS的合成。

圖1 大腸桿菌K4莢膜多糖合成基因簇的轉(zhuǎn)錄［21］Fig.1 Transcription of E.coli K4 CPS gene cluster［21］

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌K4(E.coli O5:K4:H4)購買于美國典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)，保藏編號為ATCC 23502;大腸桿菌JM109為筆者所在實驗室保藏;質(zhì)粒pKD46(含有受ParaB啟動子調(diào)控的exo、bet和gam基因)、pKD4(含有卡那霉素抗性)、pCP20(含有翻轉(zhuǎn)酶重組酶基因)均由美國Purdue大學(xué)B.L.Wanner惠贈;克隆質(zhì)粒pMD18-T購買于Takara公司。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

Red同源重組過程和種子培養(yǎng)基均用LB培養(yǎng)基。根據(jù)菌株和所用質(zhì)粒的抗性在培養(yǎng)基中添加抗生素，氨芐青霉素50 ～100 mg/L，卡那霉素25～50 mg/L。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油20，大豆蛋白胨 1，KH2PO42，K2HPO49.7，(NH4)2SO43，檸檬酸三鈉0.5，MgCl20.1。培養(yǎng)條件為37℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3 Red 同源重組［22］

1.3.1 同源重組引物設(shè)計與敲除框的構(gòu)建

利用軟件Primer Premier 5設(shè)計同源重組引物，其設(shè)計位點如圖2。擴(kuò)增pKD4卡那霉素抗性基因kan的引物P3(5'-ATGATGTGATCCTAATCTCTTCAGGTATGCTACCGCCCCTGGCTTAACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3')、P4(5'-TGTATTTTGTGTAGTCTGGAAATTAGTAAAATTCCTGGAGATAATCAGAAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3')和P8(5'-ACTTTCTGGACTTCAAATCCACTTCTTGCCATTTGATGATGTGATCCTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3')分別由2部分組成，靠近5'端的序列與PR3待敲除序列兩翼序列同源，靠近3'端斜體加粗的序列與kan基因兩側(cè)序列互補(bǔ)。在PR3啟動子UTR兩側(cè)，設(shè)計引物P1(5'-ATCAGCGTCTCAAGCAGTG-3')、P2(5'-AGGAACTTCGAAGCAGCTCCAGCCTACACAGTTAAGCCAGGGGCGGTA-3')、P7(5'-ATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGAAGCAGCTCCAGCCTACACTAGGATCACATCATCAAATGGCAAG-3')用于擴(kuò)增敲除框的右翼，P2和P7靠近5'端的序列與kan基因序列同源，靠近3'端斜體加粗序列與UTR+698 bp和+724 bp互補(bǔ)。P5(5'-ATATTCATATGGACCATGGCTAATTCCCATTTCTGATTATCTCCAGGAAT-3')和P6(5'-CTTAGCCCAATGGTGAGT-3')用于擴(kuò)增敲除框的左翼，P5靠近5'端的序列與kan基因序列同源，靠近3'端斜體加粗序列與UTR+36 bp互補(bǔ)。所用引物由上海生工生物工程公司合成。

以大腸桿菌K4基因組和pKD4為模板，利用上述引物可擴(kuò)增得到敲除框的左翼片段、右翼片段和kan基因片段。將此3種片段以等摩爾濃度混勻后作為模板，以P1和P6為引物進(jìn)行融合PCR，最終得到帶有300～400 bp同源臂的敲除框。

1.3.2 感受態(tài)的制備

圖2 同源重組引物設(shè)計位點Fig.2 Localsites of primers used for Red recombination

將培養(yǎng)12 h含有 pKD46的大腸桿菌 K4，以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)1 h后加入0.5 mL 1 mol/L的L-阿拉伯糖，培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6。將50 mL培養(yǎng)液冰浴30 min后，4℃、8 000 r/min離心3 min。收集菌體，用預(yù)冷無菌水洗滌菌體1次，用預(yù)冷10%(體積分?jǐn)?shù))甘油洗滌菌體2次，最后加入200 μL預(yù)冷10%甘油重懸菌體制備成感受態(tài)細(xì)胞。

1.3.3 電擊轉(zhuǎn)化與篩選

取100～200 ng敲除框DNA與50 μL感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴10 min。用 Bio-Rad公司 MicroPulser電穿孔儀進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，0.1 cm電擊杯，轉(zhuǎn)化參數(shù)為1.8 kV、5 ms、25 F、200 Ω。電擊后加入 1 mL LB培養(yǎng)基，37℃預(yù)培養(yǎng)1 h，涂布于含有卡那霉素的LB平板。37℃倒置培養(yǎng)12～16 h，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子在43℃培養(yǎng)12 h篩選氨芐青霉素缺失菌株。然后，按照1.3.2的方法制備感受態(tài)(不加L-阿拉伯糖)，電擊轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pCP20。轉(zhuǎn)化液涂布于含有氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)12 h，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子再轉(zhuǎn)入43℃培養(yǎng)12 h篩選氨芐青霉素和卡那霉素同時缺失的突變株。

1.4 熒光定量PCR

發(fā)酵培養(yǎng)突變株和原菌至對數(shù)生長末期，取約109個細(xì)胞，按照細(xì)菌總RNA提取試劑盒(天根)提取總RNA，并設(shè)3個重復(fù)。經(jīng)非變性凝膠電泳檢測后通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bio-Rad公司)得到cDNA。以cca和idnT基因作為雙內(nèi)參基因，對kpsE、kfoC和kpsM基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量，所用擴(kuò)增引物由Beacon Designer 7設(shè)計(表1)。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL(3 個平行):無菌水6 μL、cDNA 2 μL、引物各 1 μL、SYBR Green supermix(Bio-Rad 公司)10 μL。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s，50℃退火10 s，40個循環(huán);融解曲線:65℃到95℃，每上升0.5℃保持10 s。反應(yīng)結(jié)果利用Bio-Rad CFX Maneger軟件采用 2－ΔΔCt法進(jìn)行分析。

表1 熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers used for quantitative real time PCR

1.5 分析方法

1.5.1 K4CPS含量的測定

發(fā)酵液8 000 r/min離心3 min收集上清液，取少量上清液經(jīng)蒸發(fā)濃縮后，加入1 mL無水乙醇洗去雜質(zhì)。離心所得沉淀加入適量去離子水重懸，用于K4CPS含量的測定。K4CPS含量用咔唑法測定［25］:取5 mL濃H2SO4(含有9.5 g/L四硼酸鈉)與1 mL樣品混勻，煮沸10 min;迅速冷卻至室溫，加入200 μL咔唑溶液(0.125 g咔唑溶于乙醇中)振蕩混勻后煮沸15 min，迅速冷卻至室溫。在530 nm處測定吸光值。以硫酸軟骨素A(Sigma公司)為標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量濃度梯度為25～125 mg/L，最終所得K4CPS含量(mg/L)=標(biāo)準(zhǔn)曲線得到濃度×稀釋倍數(shù)×1.12。

1.5.2 甘油濃度的測定

采用高效液相色譜儀UltiMate 3000(Dionex公司)檢測上清液中甘油的含量，條件:分離柱Aminex HPX-87H column(Bio-Rad公司)，柱溫35℃，進(jìn)樣量 20 μL，流動相為體積分?jǐn)?shù) 0.027 5%H2SO4溶液，流動相流速 0.6 mL/min，示差折光檢測器(RID)。

1.5.3 細(xì)胞干質(zhì)量的測定

將發(fā)酵液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，在600 nm處測定其吸光值，細(xì)胞干質(zhì)量(DCW)=吸光值×稀釋倍數(shù) ×0.412。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌K4 PR3啟動子的克隆和序列同源性分析

以大腸桿菌K4基因組為模板，以P1和P6為引物PCR擴(kuò)增得到1條約1.4 kb的片段。純化后連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，篩選得到帶有PR3啟動子的重組子。重組質(zhì)粒pMD18-PR3經(jīng)測序分析，插入片段長度為1 403 bp，包括PR3啟動子及其3'端的741 bp UTR和kpsM基因的5'端。通過Blast比對分析發(fā)現(xiàn):大腸桿菌 K4與K5的PR3啟動子的同源性為96.54%，轉(zhuǎn)錄起始位點由A變?yōu)镚。

2.2 PR3啟動子3'端UTR缺失突變株的構(gòu)建與驗證

以P3、P4(或 P8)為引物，pKD4為模板，擴(kuò)增kan基因，PCR產(chǎn)物約1.5 kb;以P1、P2(或P7)為引物，大腸桿菌K4基因組DNA為模板，擴(kuò)增UTR左側(cè)序列，約 400 bp;以 P5、P6為引物，K4基因組DNA為模板，擴(kuò)增UTR右側(cè)序列，約300 bp。三段PCR產(chǎn)物經(jīng)過融合PCR分別得到2條約2.2 kb的敲除框。按照1.3 Red同源重組技術(shù)對UTR區(qū)進(jìn)行缺失突變，得到4株UTR區(qū)加長或縮短的突變菌株。敲除流程如圖3(a)所示。由圖3可知:由2條敲除框經(jīng)過第一次同源重組將kan基因整合到UTR區(qū)分別得到突變株P(guān)R301::kan和PR303::kan。隨后在翻轉(zhuǎn)酶的作用下，kan基因兩側(cè)的FRT位點發(fā)現(xiàn)第二次同源重組，kan基因丟失得到突變株P(guān)R301和PR303。表2為上述突變菌株的特性，其中菌株P(guān)R301::kan(PR301)在保留ops序列的同時延長(縮短)UTR序列;而PR303::kan(PR303)則是缺失ops序列的同時延長(縮短)UTR序列。引物P1和P6進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)重組前后序列長度的變化進(jìn)行驗證(圖3b)，并將PCR產(chǎn)物送至華大基因測序，結(jié)果與預(yù)期相符。

表2 突變株特性Table 2 Characteristics of mutants

圖3 UTR缺失突變株的構(gòu)建及PCR鑒定Fig.3 Construction of mutants with UTR deletion and PCR analysis

2.3 UTR缺失突變對K4CPS合成的影響

為研究UTR缺失突變后對K4CPS生產(chǎn)的影響，將原菌E.coli K4與UTR突變株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24 h，檢測其細(xì)胞生長、甘油利用和K4CPS合成的情況，結(jié)果如表3所示。由表3可知:與原菌相比，4株突變株的生物量和甘油利用率變化并不顯著。其中，突變株 PR301::kan和 PR301的K4CPS產(chǎn)量與E.coli K4也無明顯的變化，這一結(jié)果表明，在ops序列存在的情況下，UTR序列的延長或縮短并不能影響K4CPS產(chǎn)量。然而，對于菌株P(guān)R303::kan，在ops序列缺失和延長UTR序列的雙重調(diào)控下，可導(dǎo)致K4CPS產(chǎn)量的降低，比原菌下降了16%;反之，在ops序列缺失的基礎(chǔ)上，縮短UTR序列至166 bp可顯著提高菌株P(guān)R303生產(chǎn)K4CPS的能力，使其產(chǎn)量達(dá)751 mg/L，而比細(xì)胞得率高達(dá)0.214 g(以1 g干細(xì)胞質(zhì)量中含K4CPS量計)，比原菌分別提高了46% 和51%。上述結(jié)果表明:缺失 ops序列且縮短UTR能有效地提高K4CPS產(chǎn)量;ops序列或RfaH蛋白并不是K4CPS合成的必需蛋白。

表3 突變株與原菌的K4CPS產(chǎn)量對比Table 3 K4CPS production in mutants and E.coli K4

2.4 UTR缺失突變對PR3啟動子強(qiáng)度的影響

為了解析UTR突變?nèi)绾斡绊慘4CPS合成，選取K4CPS合成基因簇中region 1、region 2和region 3的代表性基因kpsE、kfoC和kpsM，以cca和idnT基因為雙內(nèi)參基因，通過熒光定量PCR對kpsM、kfoC、kpsE基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量，結(jié)果見圖4。由圖4可知:與原菌相比，在突變菌株P(guān)R301::kan和PR301中，3個基因的表達(dá)水平均無顯著變化，而在PR303::kan中，kpsM和kfoC基因的表達(dá)水平則分別下降為原菌的58% 和68%;但在PR303中kpsM和kfoC基因的表達(dá)水平則分別提高了1.04和1.16倍。此外，4株突變菌的kpsE基因表達(dá)水平均無顯著變化，說明UTR的突變對region 1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)沒有明顯的影響。因此，從基因轉(zhuǎn)錄水平上研究表明，在ops序列存在的情況下，UTR序列的延長或縮短都難以影響PR3啟動子的強(qiáng)度，而ops序列缺失后，UTR區(qū)的延長能減弱PR3啟動子的強(qiáng)度，UTR區(qū)的縮短則能有效地加強(qiáng)PR3啟動子的強(qiáng)度。上述結(jié)果表明，RfaH蛋白的與ops序列的結(jié)合會影響UTR區(qū)對PR3啟動子的調(diào)控作用，但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖4 莢膜多糖合成基因簇基因表達(dá)水平分析比較結(jié)果Fig.4 Analysis of expression levels of genes in capsule gene cluster

3 討論

目前，國內(nèi)外研究人員已從多方面對發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素開展了卓有成效的研究工作。然而，由于微生物自身代謝的經(jīng)濟(jì)型生存本能和工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境與自然環(huán)境的巨大差異，使硫酸軟骨素的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度均難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此，利用基因工程手段獲得硫酸軟骨素高產(chǎn)菌株已成為硫酸軟骨素研究領(lǐng)域的熱點和重點［7］，如過量表達(dá)K4CPS合成途徑中的軟骨素酶合成基因可有效提高 K4CPS產(chǎn)量［26］。此外，過量表達(dá)UDP-葡萄糖脫氫酶能夠使莢膜多糖合成前體UDPGlcA的產(chǎn)量提高3倍，但意外的是，K4CPS的產(chǎn)量并沒有提高，反而顯著地降低了3倍［27］。其原因可能是硫酸軟骨素等莢膜多糖的合成涉及單糖合成、核糖供應(yīng)、酶動力學(xué)反應(yīng)以及膜轉(zhuǎn)運蛋白等多個環(huán)節(jié)，僅對單一或者2～3個基因進(jìn)行代謝工程改造難以顯著提高K4CPS生產(chǎn)效率。因此，如要提高硫酸軟骨素的產(chǎn)量，需要同時對多個基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控。

同時提高胞內(nèi)多個基因表達(dá)水平的另一策略是過量表達(dá)全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，如增加fis基因(編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白)拷貝數(shù)和突變σ因子均能提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)量［28－29］。但需考慮的是對具有潛在致病性的生產(chǎn)菌株進(jìn)行全局轉(zhuǎn)錄蛋白調(diào)控時，可能會引起多種毒性因子(如脂多糖)的變化。在對莢膜多糖合成基因簇轉(zhuǎn)錄調(diào)控子進(jìn)行詳盡分析的基礎(chǔ)上，采用Red同源重組技術(shù)對莢膜多糖合成基因簇PR3啟動子進(jìn)行改造，在ops序列缺失的基礎(chǔ)上縮短PR3啟動子3'端UTR的長度，增強(qiáng)PR3啟動子的活性。使region 2和region 3的表達(dá)水平同時得到了提高，從而顯著提高了K4CPS的生產(chǎn)效能，其比細(xì)胞得率達(dá)到214 mg/g，為目前報道的最高水平。分析其原因可能為:region 2中負(fù)責(zé)編碼K4CPS多糖聚合酶(KfoC)及其單糖前體UDP-GalNAc與UDP-GlcA合成相關(guān)酶(分別為KfoA和KfoF)表達(dá)水平的提高，增強(qiáng)了胞質(zhì)中單糖前體合成和多糖聚合的代謝強(qiáng)度;由于region 3中KpsM和KpsT蛋白組成的ABC-A2型轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的加強(qiáng)，加速了K4CPS多糖鏈從胞內(nèi)向胞外的轉(zhuǎn)運;同時提高胞內(nèi)K4CPS合成強(qiáng)度與跨膜轉(zhuǎn)運速率可能更有利于胞外K4CPS的高效積累。這一研究表明，通過啟動子工程從轉(zhuǎn)錄水平對莢膜多糖合成基因簇進(jìn)行整體調(diào)控，能顯著促進(jìn)莢膜多糖的合成，為相關(guān)研究提供了新的代謝工程策略。

［1］ 翟中和，王喜忠，丁明孝.細(xì)胞生物學(xué)［M］.3版.北京:高等教育出版社，2008.

［2］ Zhou S.Health food useful for improving water content of skin，obtained bymixingcomponentsincludinghyaluronicacid，chondroitin sulfate，fish collagen，vitamin C powder，glycine，proline，extract of grape seeds and starch:CN，102210425A［P］.2011-10-12.

［3］ WadaT，Mano T，TanouchiM.Composition usefulin pharmaceuticals and food-drinks for treating asthenopia，comprises mixture of chondroitin sulfate:WO，2011136159A1［P］.2011-03-11.

［4］ Schiraldi C，Cimini D，DeRosa M.Production of chondroitin sulfate and chondroitin［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，87(4):1209-1220.

［5］ Lauder R.Chondroitin sulphate:acomplexmoleculewith potential impacts on a wide range of biological systems［J］.Complement Ther Med，2009，17(1):56-62.

［6］ DeAngelis P.Chondroitin synthase gene and methods of making and using same:US，7569386B2［P］.2005-06-24.

［7］ 吳秋林，劉立明，陳堅.發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的研究進(jìn)展［J］.生物工程學(xué)報，2012，28(11):1281-1293.

［8］ Rrodriguez M L，Jann B，Jann K.Structure and serological characteristics of the capsular K4 antigen of Escherichia coli O5:K4:H4，a fructose-containing polysaccharide with a chondroitin backbone［J］.Eur J Biochem，1988，177(1):117-124.

［9］ DeAngelis P L，Gunay N S，Toida T，et al.Identification of the capsular polysaccharides of type D and F Pasteurella multocida as unmodified heparin and chondroitin，respectively［J］.Carbohydr Res，2002，337(17):1547-1552.

［10］ Jolly J，Klimaszewski K，Nakanishi Y，et al.Microbial-derived chondroitin sulfate:US，20100063001A1［P］.2009-06-03.

［11］ Chong B，Blank L，Mclaughlin R，et al.Microbial hyaluronic acid production［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2005，66(4):341-351.

［12］ Vann W，Schmidt M，Jann B，et al.The structure of the capsular polysaccharide(K5 antigen)of urinary-tract-infective Escherichia coli 010:K5:H4:a polymer similar to desulfo-heparin［J］.Eur J Biochem，1981，116(2):359-364.

［13］ Bedini E，DeCastro C，DeRosa M，et al.A microbiologicalchemical strategy to produce chondroitin sulfate A，C［J］.Angew Chem Int Ed，2011，50(27):6160-6163.

［14］ Schiraldi C，Restaino O，Cimini D，et al.High cell density cultivation of Escherichia coli K4 in a microfiltration bioreactor:a step towards improvement of chondroitin precursor production［J］.Microb Cell Fact，2011，10(1):10-19.

［15］ Whitfield C，Roberts I.Structure，assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli［J］.Mol Microbiol，1999，31(5):1307-1319.

［16］ Whitfield C. Biosynthesis and assembly of capsular polysaccharides in Escherichia coli［J］.Annu Rev Biochem，2006，75:39-68.

［17］ Roberts I，Mountford R，Hodge R，et al.Common organization of gene clusters for production of different capsular polysaccharides(K antigens)in Escherichia coli［J］.J Bacteriol，1988，170(3):1305-1310.

［18］ Ninomiya T，Sugiura N，Tawada A，et al.Molecular cloning and characterization of chondroitin polymerase from Escherichia coli strain K4［J］.J Biol Chem，2002，277(24):21567-21575.

［19］ Simpson D A，Hammarton T C，Roberts I S.Transcriptional organization and regulation of expression of region 1 of the Escherichia coli K5 capsule gene cluster［J］.J Bacteriol，1996，178(22):6466-6474.

［20］ Stevens M P，Clarke B R，Roberts I S.Regulation of the Escherichia coliK5 capsule gene clusterby transcription antitermination［J］.Mol Microbiol，1997，24(5):1001-1012.

［21］ Xue P，Corbett D，Goldrick M，et al.Regulation of expression of the region 3 promoter of the Escherichia coli K5 capsule gene cluster involves H-NS，SlyA，and a large 5'untranslated region［J］.J Bacteriol，2009，191(6):1838-1846.

［22］ Datsenko K A，Wanner B L.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products［J］.PNAS，2000，97(12):6640.

［23］ Lidholt K，F(xiàn)jelstad M.Biosynthesis of the Escherichia coli K4 capsule polysaccharide:a parallelsystem for studies of glycosyltransferases in chondroitin formation［J］.J Biol Chem，1997，272(5):2682-2687.

［24］ Zhou K，Zhou L，Lim Q，et al.Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR［J］.BMC Mol Biol，2011，12(1):18.

［25］ Zanfardino A，Restaino O，Notomista E，et al.Isolation of an Escherichia coliK4 kfoC mutantover-producing capsular chondroitin［J］.Microb Cell Fact，2010，9(1):34-41.

［26］ Cimini D，DeRosa M，Viggiani A，et al.Improved fructosylated chondroitin production by kfoC overexpression in E.coli K4［J］.J Biotechnol，2010，150(3):324-331.

［27］ Roman E，Roberts I S，Lidholt K，et al.Overexpression of UDP-glucose dehydrogenase in Escherichia coli results in decreased biosynthesis of K5 polysaccharide［J］.Biochem J，2003，374(3):767-772.

［28］ Yu H，Tyo K，Alper H，et al.A high-throughput screen for hyaluronic acid accumulation in recombinant Escherichia coli transformed bylibraries ofengineered sigma factors［J］.Biotechnol Bioeng，2008，101(4):788-796.

［29］ Steen J A，Steen J A，Harrison P，et al.Fis is essential for capsule production in Pasteurella multocida and regulates expression of other important virulence factors［J］.PloS Pathogens，2010，6(2):e1000750.