原位吸附浸沒式膜生物反應(yīng)器催化制備茚二醇

成喜雨，王 靜，柯 屾

(1.北京交通大學(xué) 理學(xué)院 生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044;2.北京節(jié)能環(huán)保促進(jìn)會(huì)，北京 100195)

全細(xì)胞生物催化是可持續(xù)藥物生產(chǎn)過程中的重要一環(huán)，該過程存在的一個(gè)主要問題是微生物所面臨的底物和產(chǎn)物抑制［1－3］。惡臭假單胞菌催化茚合成順式茚二醇就是一個(gè)典型例子，在此過程中，可以使用硅油建立液-液兩相系統(tǒng)，降低茚對(duì)微生物的抑制［4－5］。但該過程存在的乳化問題，使下游產(chǎn)物分離變得困難;也可以使用高分子聚合物建立固-液兩相系統(tǒng)，降低抑制的同時(shí)可以消除液-液兩相系統(tǒng)存在的乳化問題［6－7］，然而，聚合物顆粒的大量使用使過程復(fù)雜化，可能提高過程能耗和操作費(fèi)用。膜反應(yīng)器被報(bào)道可克服底物抑制，如利用中空纖維膜固定化微生物，可以明顯提高微生物對(duì)廢水中不同底物的耐受性［8－10］。

膜反應(yīng)器用于廢水處理已得到了廣泛認(rèn)可，由此筆者提出采用浸沒式膜反應(yīng)器(IMB)降低生物催化過程中的抑制問題。但在生物催化過程中底物的溶解度、毒性均不同于廢水組分，因此所提出的IMB無論過程操作還是機(jī)制都與傳統(tǒng)的膜生物反應(yīng)器不同。在IMB中，膜既作為載體固定化細(xì)胞，又可作為第二相來吸附不溶性底物，從兩方面降低過程抑制。筆者對(duì)比研究了IMB和懸浮細(xì)胞反應(yīng)器的性能，考察過程加強(qiáng)機(jī)制，并進(jìn)一步將原位吸附與IMB耦合，以期提高過程效率，為其在生物催化方面的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑和菌株

茚購于Sigma公司，其中分析用的茚純度為98%，生物催化實(shí)驗(yàn)用的茚純度為90%;順式茚二醇購于美國Wako公司;TSA(tryptic soy agar)、TSB(tryptic soy broth)培養(yǎng)基購于美國BD Biosciences公司;常規(guī)用化學(xué)試劑都購于Sigma公司或北京化學(xué)試劑公司。

惡臭假單胞菌ATCC55687購于美國ATCC菌種中心。菌株用TSA斜面培養(yǎng)基傳代保存。種子準(zhǔn)備過程如下:從斜面挑取1環(huán)菌，接種于裝有150 mL TSB培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶在200 r/min、30℃搖床上恒溫培養(yǎng)過夜獲得種子。

1.2 膜組件制備

實(shí)驗(yàn)用中空纖維膜為聚偏氟乙烯(PVDF)膜，購于廈門鯤揚(yáng)膜科技有限公司。膜絲外徑2.2 mm，內(nèi)有一聚酯支撐層，膜絲截面圖見圖1。其聚酯支撐層由纖維細(xì)絲編網(wǎng)而成，纖維細(xì)絲間距5 μm左右(圖1(b)和圖1(c))。膜組件制備過程如下:取一定數(shù)量16 cm長膜絲，將此組膜絲兩端長大約2 cm以內(nèi)的膜絲之間均勻涂抹環(huán)氧樹脂膠，使2個(gè)端口的膜絲之間沒有間隙，之后將這組膜絲的兩端置入長約1.5 cm長的玻璃或者聚丙烯小管內(nèi)，將環(huán)氧樹脂膠注入膜絲與小管之間間隙，在恒溫烘箱干燥6 h左右，直至膠完全干燥，用鋒利刀片切割兩端獲得平整斷面，即獲得膜組件。取合適直徑硅膠管連接小管和循環(huán)用管路，經(jīng)過滅菌后即可用于生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 PVDF中空纖維膜掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 SEM images of PVDF hollow fiber membrane

1.3 懸浮培養(yǎng)生物催化過程

實(shí)驗(yàn)采用懸浮細(xì)胞反應(yīng)器(SCB)作為IMB生物催化過程的對(duì)照。實(shí)驗(yàn)在裝有150 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中進(jìn)行，壓縮空氣通過滅菌后的過濾器(美國Milipore公司)進(jìn)行無菌過濾，然后以75 mL/min的速率通入三角瓶反應(yīng)器中。反應(yīng)器的接種量為2.5%(體積分?jǐn)?shù))，種子液吸光值約5。生物催化反應(yīng)所用培養(yǎng)基為MMG培養(yǎng)基［4］，C源為20 g/L葡萄糖。茚作為反應(yīng)底物，在接種同時(shí)按照預(yù)定的濃度直接加入培養(yǎng)基中，然后將三角瓶置于200 r/min、30℃水浴搖床進(jìn)行反應(yīng)，在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取樣1 mL進(jìn)行分析。

1.4 IMB生物催化過程

IMB實(shí)驗(yàn)裝置如圖2所示。IMB與SCB相似，不同的是三角瓶反應(yīng)器加入了一個(gè)膜組件。膜組件與聚四氟乙烯(PTFE)循環(huán)管路連接，將膜組件浸入三角瓶培養(yǎng)基中，然后用蠕動(dòng)泵以5 mL/min速率將培養(yǎng)基從三角瓶循環(huán)進(jìn)入膜組件一端，從另一端返回三角瓶中，其余所有操作條件同SCB反應(yīng)器。培養(yǎng)基和器皿采用高溫滅菌，而膜組件和循環(huán)管路采用70%乙醇溶液循環(huán)浸泡5 h以上進(jìn)行滅菌，之后用無菌蒸餾水循環(huán)沖洗6次以上，以去除酒精殘留。

圖2 IMB流程Fig.2 Flow chart of the immersed membrane bioreactor(IMB)

膜反應(yīng)器中細(xì)胞固定化方法如下:將膜組件浸入種子培養(yǎng)瓶中，連接循環(huán)管路，用蠕動(dòng)泵將三角瓶中種子液從膜組件一端泵入，種子液從膜組件另一端返回三角瓶中，如此循環(huán)12 h，使細(xì)胞吸附固定到膜絲表面和內(nèi)部聚酯纖維支撐層的細(xì)絲之間。之后，將膜組件取出，用無菌蒸餾水輕輕淋洗表面，再置入含150 mL MMG培養(yǎng)基的三角瓶反應(yīng)器中，同時(shí)將茚按照預(yù)定的濃度直接加入培養(yǎng)基中，然后將三角瓶置于200 r/min、30℃水浴搖床進(jìn)行反應(yīng)，在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取樣1 mL進(jìn)行分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣。

原位吸收反應(yīng)器設(shè)置與圖2基本相同，不同的是在反應(yīng)開始時(shí)在反應(yīng)器中添加1個(gè)包含有滅菌樹脂的小包。樹脂sp 207購買自Sigma公司，樹脂用58 μm的尼龍布做成的小包包裹，采用70%的酒精溶液進(jìn)行滅菌，之后用無菌蒸餾水清洗后用于生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中。

1.5 分析

細(xì)胞濃度采用分光光度計(jì)測定，測定波長為600 nm。產(chǎn)物和副產(chǎn)物茚酮測定采用HPLC進(jìn)行，色譜條件如下:安捷倫Zorbax RX-C8色譜柱，紫外檢測器，檢測波長為220 nm，其余設(shè)置參照文獻(xiàn)［4］。副產(chǎn)物茚酚市場上沒有標(biāo)準(zhǔn)品，因此未進(jìn)行定量檢測。實(shí)驗(yàn)過程中收集一定量的樣品，10 000 r/min離心10 min，取上清，用2-丙醇稀釋，再使用0.45 μm PVDF膜過濾后用于HPLC分析。

茚不溶于水，同時(shí)反應(yīng)過程可能吸附到膜組件和反應(yīng)器內(nèi)壁，很難準(zhǔn)確定量測定過程中茚濃度，因此過程主要監(jiān)測順式茚二醇的濃度，最終通過產(chǎn)物順式茚二醇濃度和初始茚添加量計(jì)算產(chǎn)率。

2 結(jié)果和討論

2.1 SCB中順式茚二醇合成

首先對(duì)SCB中細(xì)胞生長和順式茚二醇合成的抑制情況進(jìn)行了研究，作為IMB反應(yīng)器運(yùn)行結(jié)果的對(duì)照，結(jié)果見圖3。由圖3可知:在不添加底物茚的MMG培養(yǎng)基中，惡臭假單胞菌ATCC55687生長幾乎沒有延滯期，2 h后開始對(duì)數(shù)生長，比生長速率達(dá)0.6 h－1，8 h后生物生物量達(dá)到較高水平，之后進(jìn)入緩慢生長期，24 h后OD600達(dá)5.3。當(dāng)反應(yīng)器中加入3 g/L茚作為底物，細(xì)胞生長受到明顯抑制，比生長速率降低到0.4 h－1;當(dāng)?shù)孜镘豳|(zhì)量濃度增加到6 g/L，細(xì)胞生長受到嚴(yán)重抑制，比生長速率降低到0.3 h－1，24 h 后 OD600僅 1.6。

由圖3還可知:在茚質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)，4 h后觀察到順式茚二醇的快速合成，12 h后進(jìn)入平臺(tái)期，18 h后順式茚二醇質(zhì)量濃度達(dá)到107 mg/L，平均容積產(chǎn)率為6 mg/(L·h)，過程摩爾產(chǎn)率很低，只有0.03 mol/mol(以1 mol茚計(jì))。在6 g/L茚條件下，順式茚二醇合成受到更嚴(yán)重抑制，順式茚二醇質(zhì)量濃度和摩爾產(chǎn)率分別低至84 mg/L和0.01 mol/mol。

圖3 在SCB中茚濃度對(duì)細(xì)菌生長和順式茚二醇合成的影響Fig.3 Effects of indene on cell growth and cisindandiol biosynthesis in the SCB

在惡臭假單胞菌催化茚合成順式茚二醇的模式系統(tǒng)中，副產(chǎn)物比較多，這是其摩爾產(chǎn)率較低的原因之一，同時(shí)，茚不溶于水，通氣過程中氣提作用會(huì)造成底物損失，從而降低其產(chǎn)率［6］。底物和產(chǎn)物抑制是造成終產(chǎn)物濃度和摩爾產(chǎn)率降低的主要原因之一［4］，上述研究結(jié)果也表明，SCB中細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成受到了明顯抑制。

2.2 IMB中順式茚二醇合成

進(jìn)一步研究IMB反應(yīng)器降低上述全細(xì)胞催化過程普遍存在的底物和產(chǎn)物抑制的效果。IMB中既有固定化細(xì)胞(圖1(d))，又有懸浮細(xì)胞，因?yàn)槟そM件上吸附固定的微生物難以定量，因此對(duì)IMB中懸浮培養(yǎng)物濃度進(jìn)行了監(jiān)測，評(píng)估IMB對(duì)微生物生長的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知:與SCB相比，在使用12根膜絲的IMB-S中，即使在6 g/L的高底物濃度下，經(jīng)過4 h的延滯期，細(xì)胞開始快速增長，比生長速率在0.4 h－1;24 h后細(xì)胞濃度為4.5，明顯高于SCB中相應(yīng)底物濃度下的水平(1.6)。膜組件中膜絲數(shù)量的調(diào)整也有利于降低底物對(duì)細(xì)胞生長的抑制，在使用25根膜絲的IMB-L中，懸浮細(xì)胞生長更快，在3 g/L的高底物濃度下，8 h左右OD600水平達(dá)到4.7，而在IMB-S中，達(dá)到相似水平需要到18 h。

在SCB中，在底物質(zhì)量濃度分別為3和6 g/L時(shí)，順式茚二醇質(zhì)量濃度分別為107和84 mg/L。與之相比，IMB-S中產(chǎn)物合成量得到了明顯的提高，分別達(dá)358和404 mg/L，摩爾產(chǎn)率則分別提高到0.08和0.05 mol/mol。反應(yīng)周期也從SCB中的18 h延長到30 h，但容積產(chǎn)率達(dá)12 mg/(L·h)，是SCB中水平的2倍。

圖4 在IMB中茚濃度下對(duì)細(xì)菌生長和順式茚二醇合成的影響Fig.4 Effects of indene concentration on cell growth and cis-indandiol biosynthesis in the IMB

由圖4還可知:通過增加膜組件中膜絲數(shù)量，順式茚二醇合成速率和終濃度都得到了進(jìn)一步提高。在底物為3 g/L時(shí)，培養(yǎng)18 h后順式茚二醇質(zhì)量濃度就達(dá)到425 mg/L，24 h后達(dá)到461 mg/L，容積產(chǎn)率達(dá)19 mg/(L·h)，較IMB-S提高60%，是 SCB中水平的3倍。

IMB對(duì)順式茚二醇過程的加強(qiáng)可能通過2種不同的機(jī)制。一方面，在IMB中固定化細(xì)胞可以提高反應(yīng)器中細(xì)胞濃度，通過細(xì)胞固定化，微生物可以耐受更高濃度的底物［9］。增加膜絲數(shù)量將增加固定化微生物濃度，從而加強(qiáng)生物轉(zhuǎn)化效率，在IMB-L中比在IMB-S中更高的產(chǎn)物濃度和容積產(chǎn)率證實(shí)了這一點(diǎn)。另一方面，用于IMB的PVDF膜具有較強(qiáng)的疏水性，與疏水的不溶性底物茚具有較好的親和性，因而可以吸附茚，降低其對(duì)反應(yīng)器中懸浮細(xì)胞抑制的同時(shí)，使IMB中懸浮細(xì)胞液可以獲得很好生長，還可以減少通氣過程造成的底物茚損失。

Dafoe等［6］報(bào)道了1個(gè)兩相反應(yīng)器，采用聚合物顆粒取代硅油作為第二相，過程效率得到大幅加強(qiáng)，指出聚合物顆粒對(duì)底物、副產(chǎn)物和產(chǎn)物的吸附是過程加強(qiáng)的重要原因。筆者的研究結(jié)果表明，膜組件對(duì)可溶性產(chǎn)物和副產(chǎn)物親和性較低。在底物為3 g/L時(shí)，在IMB-S中，發(fā)酵終點(diǎn)順式茚二醇和茚酮在膜相中分配比例分別為3%和27%(數(shù)據(jù)未顯示)，其余部分存留在水相中;在IMB-L中，由于膜絲數(shù)量增加，順式茚二醇和茚酮在膜相中分配比例增加到6%和46%。由此可見，在IMB中，膜組件本身不能通過吸附移除產(chǎn)物來降低產(chǎn)物抑制，過程加強(qiáng)應(yīng)該是通過固定化來提高微生物耐受性與通過膜組件對(duì)底物茚的吸附來降低底物茚的抑制的共同作用完成的。同時(shí)，膜組件對(duì)副產(chǎn)物茚酮具有一定的吸附作用，這種吸附隨著膜絲數(shù)量的增加而得到增強(qiáng)，對(duì)過程加強(qiáng)將產(chǎn)生一定貢獻(xiàn)。

2.3 原位吸附IMB中順式茚二醇合成

從上面結(jié)果知道，膜組件本身并不能吸附順式茚二醇，因此，進(jìn)一步考察通過樹脂原位吸附提高過程效率的可能性。在3 g/L底物質(zhì)量濃度下，在IMB-L中，于接種的同時(shí)分別加入0.5%、1%、2%和4%的滅菌處理過的sp-207樹脂，考察原位吸附對(duì)細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的影響，結(jié)果見圖5。由圖5(a)可知:樹脂的添加量在5～10 g/L時(shí)對(duì)生長過程影響不大，而添加量增加到20～40 g/L時(shí)，生長明顯受到影響。

由圖5(b)可知:樹脂的添加量在5～10 g/L時(shí)，順式茚二醇總濃度隨著樹脂的添加量增加而增加;進(jìn)一步增加樹脂，產(chǎn)物產(chǎn)量有所降低。在10 g/L樹脂添加量下，順式茚二醇總質(zhì)量濃度最高，達(dá)709 mg/L，比無樹脂添加的IMB-L中產(chǎn)量提高45%，是SCB中產(chǎn)量的6.6倍。相應(yīng)地，摩爾產(chǎn)率從SCB的0.03提高到0.18 mol/mol;容積產(chǎn)率提高到30 mg/(L·h)，是SCB中水平的5倍。

由圖5(b)可以發(fā)現(xiàn):產(chǎn)物在水相、樹脂相和膜相的分布情況，根據(jù)該數(shù)據(jù)可以計(jì)算到產(chǎn)物順式茚二醇在各部分中的比例。在IMB-L中，因?yàn)槟け旧韺?duì)產(chǎn)物吸附性能非常弱，94%的產(chǎn)物分布在水相中，因此隨著產(chǎn)物積累，其對(duì)微生物的抑制將不斷增強(qiáng);在原位吸附IMB-L中，樹脂添加量為5～40 g/L時(shí)，生成的產(chǎn)物中有13% ～67%的量轉(zhuǎn)移到樹脂相中，通過樹脂對(duì)產(chǎn)物的吸附，產(chǎn)物抑制一定程度上得以降低，而且樹脂用量越高，水相中產(chǎn)物濃度占比越低，這可能是原位吸附IMB中生物轉(zhuǎn)化效率得到進(jìn)一步的原因之一。

圖5 樹脂添加量進(jìn)行原位吸附對(duì)IMB中細(xì)胞生長、順式茚二醇和茚酮合成的影響Fig.5 Effects of in situ adsorption using resin at different concentrations on cell growth，cis-indandiol and indanone production in the IMB at 3 g/L and 6 g/L indene

由圖5(c)可知:膜絲對(duì)茚酮有一定親和性，在IMB-L中，46%的茚酮分布在膜相中，水相中茚酮比例是54%;在原位吸附IMB-L中，樹脂添加量為5～40 g/L時(shí)，膜相中茚酮降低到21% ～33%，而樹脂中茚酮占比例為44% ～77%，最終，水相中茚酮比例降低到2%～23%。上述結(jié)果表明，樹脂添加也能移除副產(chǎn)物茚酮，移除能力隨樹脂添加量增加而增加。通過原位吸附，產(chǎn)物和副產(chǎn)物被部分或大部分移除，消除抑制，從而使IMB-L的效率得到了進(jìn)一步提高。

值得注意的是，在4個(gè)樹脂添加量的IMB反應(yīng)過程中，當(dāng)添加量為40 g/L時(shí)，在液相中無論產(chǎn)物濃度還是副產(chǎn)物茚酮濃度，都處于最低水平，但順式茚二醇總產(chǎn)量比10 g/L樹脂添加量有所降低，這可能與樹脂添加對(duì)微生物活性影響和營養(yǎng)成分的吸附有關(guān)，相似的結(jié)果在其他體系中也有所報(bào)道［11－12］。樹脂袋的加入有可能對(duì)搖瓶反應(yīng)器中傳質(zhì)和供氧產(chǎn)生負(fù)面影響，從而影響轉(zhuǎn)化效率。然而，此結(jié)果也預(yù)示在放大的反應(yīng)器系統(tǒng)中，可能可以取得比現(xiàn)有搖瓶反應(yīng)器系統(tǒng)更好的轉(zhuǎn)化效率，因?yàn)橥ㄟ^放大，可以設(shè)置分離的擴(kuò)張床系統(tǒng)，對(duì)產(chǎn)物和副產(chǎn)物進(jìn)行原位移除，同時(shí)又可以盡可能降低對(duì)微生物活性和傳質(zhì)供氧的影響。

在相同的搖瓶反應(yīng)器中，使用硅油的液-液兩相搖瓶系統(tǒng)，順式茚二醇質(zhì)量濃度在10和12 h分別達(dá)到210和250 mg/L，通過過程優(yōu)化，產(chǎn)量可以進(jìn)一步提高到 400 mg/L［4］，低于本研究原位吸附IMB-L中所得的709 mg/L的水平。通過采用聚合物顆粒替代硅油，研究者構(gòu)建了基于機(jī)械攪拌式反應(yīng)器的固-液兩相系統(tǒng)，終產(chǎn)物質(zhì)量濃度從0.29 g/L提高到1.29 g/L［6］，高于IMB-L中相應(yīng)水平。直接比較上述固-液兩相系統(tǒng)和基于搖瓶的IMB系統(tǒng)的產(chǎn)量和產(chǎn)率水平很難對(duì)2個(gè)體系給出正確的評(píng)價(jià)，因?yàn)閿嚢枋椒磻?yīng)器允許前者采用優(yōu)化的底物添加策略、具有更好的傳質(zhì)和供氧，這些都必然對(duì)過程產(chǎn)生很大影響。值得注意的是，上述固-液兩相系統(tǒng)中，容積產(chǎn)率從對(duì)照的29 mg/(L·h)提高到90 mg/(L·h)，獲得了3倍的提高;而采用IMB系統(tǒng)，容積產(chǎn)率從對(duì)照的6 mg/(L·h)提高到 30 mg/(L·h)，獲得了5倍的提高。另外，在此膜反應(yīng)器中，吸附于膜上的微生物和懸浮微生物都可以進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)基在膜組件內(nèi)部的連續(xù)循環(huán)也將控制固定化微生物和懸浮微生物的數(shù)量，傳統(tǒng)廢水處理膜生物反應(yīng)器中經(jīng)常碰到的膜污染問題在本系統(tǒng)中并未觀察到，從電鏡照片可以看到(圖1(d))，微生物并未形成致密層影響傳質(zhì)和反應(yīng)。當(dāng)前的IMB系統(tǒng)集成了固定化細(xì)胞反應(yīng)器和兩相反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)，其低的操作費(fèi)用、巨大的優(yōu)化空間為全細(xì)胞生物催化過程提供了一個(gè)可供選擇的重要途徑。

3 結(jié)論

在原位吸附IMB系統(tǒng)中，可通過細(xì)胞固定化以及底物、產(chǎn)物和副產(chǎn)物的吸附降低茚生物轉(zhuǎn)化過程抑制，順式茚二醇質(zhì)量濃度和容積產(chǎn)率分別達(dá)到709 mg/L和30 mg/(L·h)，與對(duì)照SCB相比，分別提高7和5倍。IMB系統(tǒng)操作簡單靈活，可以通過改變膜絲數(shù)量、膜結(jié)構(gòu)、膜材料和循環(huán)過程等多種方式對(duì)過程進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高過程效率。同時(shí)，IMB容易放大，在全細(xì)胞生物催化制藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。

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