離子交換樹脂對藤黃果中羥基檸檬酸的分離純化

易馨如 封 棣 王 泰 張丞林 曹學(xué)麗

YI Xin－ru 1，2，3，4 FENG Di 1，2，3，4 WANG Tai 1，2，3，4 ZH ANG Cheng－lin 1，2，3，4 CAO Xue－li 1，2，3，4

（1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048；2.食品添加劑與配料北京市高等學(xué)校工程中心，北京 100048；3.北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；4.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

（1.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing 100048，China；2.Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，School of Food and Chemical Engineering，Beijing 100048，China；3.Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry，Beijing 100048，China；4.Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

羥基檸檬酸（hydroxycitric acid，HCA）是一種天然有機(jī)酸，主要存在于盛產(chǎn)于印度次大陸和斯里蘭卡西部的藤黃屬植物 Garcinia cambogia、Garcinia indica 和Garcinia atroviridis的果實(shí)外殼中。此外，羥基檸檬酸在木槿（Hibiscus）屬植物中也有存在［1］。羥基檸檬酸易溶于水，微溶于甲醇，難溶于氯仿、石油醚和苯；分子式為C6H8O8，相對分子量為208.12，結(jié)構(gòu)式見圖1。研究［2］發(fā)現(xiàn)，羥基檸檬酸對檸檬酸裂解酶的親和力要比天然底物（檸檬酸）強(qiáng)很多，會優(yōu)先與酶結(jié)合，抑制檸檬酸裂解酶的活性，減少體內(nèi)脂肪合成。因此，羥基檸檬酸具有降低體重［3］、降低血脂［4］、抑制食欲等功效［5］，常被作為天然減肥保健品中的主要功能成分。目前國外已有14種以上含有羥基檸檬酸的減肥保健品上市［6］，而中國國內(nèi)市場上已有多種相關(guān)的功能性食品和保健品［7］。

圖1 羥基檸檬酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1 The chemical structure of hydroxycitric acid

目前國內(nèi)外學(xué)者對于羥基檸檬酸的分離純化研究較少。Moffett等［8］以藤黃果皮為原料，以水為提取溶劑進(jìn)行提取，提取液先通過陰離子交換樹脂柱，用NaOH溶液洗脫，洗脫后的液體再通過陽離子交換樹脂，最終制備得到23%～54%含量的羥基檸檬酸濃縮物。中國市場上銷售的“藤黃果提取物”產(chǎn)品大多是依據(jù)此法進(jìn)行生產(chǎn)的，其中羥基檸檬酸含量較低。離子交換樹脂是一種有機(jī)高聚物吸附劑，在中草藥有效成分的提取、分離及純化中具有廣泛的應(yīng)用。其具有吸附迅速，解吸容易等良好的吸附性能，可用于水溶性化合物的分離純化中，如小麥活性肽［9］等的分離純化。對離子交換樹脂高效分離純化羥基檸檬酸相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

本研究擬以藤黃果粗提物為起始原料，通過對不同的離子交換樹脂進(jìn)行篩選，研究靜態(tài)和動態(tài)對羥基檸檬酸純化的影響因素，以及分離純化工藝參數(shù)的優(yōu)化，探索出更適合工業(yè)化生產(chǎn)、操作簡便、低成本、純化效果好的工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤黃果粗提物：購買于北京市場；

羥基檸檬酸（HCA）對照品：純度98.70%，上海佰年詩丹德檢測技術(shù)有限公司；

離子交換樹脂：D315、D201、D301、335、HZ－202樹脂，河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司；

甲醇：色譜醇，美國Fisher公司；

磷酸：色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

NaCl、NaOH、KOH：分析純，北京化工廠；

氨水、醋酸、鹽酸、硫酸：分析純，北京化學(xué)試劑公司；

去離子水、超純水：本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：Agilent 1100型，美國Agilent公司；

超聲波清洗器：KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

超純水制備系統(tǒng)：Milli－Q型，美國Millipore公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樹脂預(yù)處理 樹脂用去離子水不停沖洗，洗至泡沫較少，水顏色較淺為止，再用3倍體積4%NaOH浸泡3 h，去離子水洗至中性；然后用3倍體積4%HCl浸泡3 h，去離子水洗至中性；最后用3倍體積4%NaOH浸泡3 h，去離子水洗至中性；浸泡備用［10］。

1.3.2 樹脂的物理參數(shù) 選擇型號為 D315、D301、D201、335、HZ－202這5種離子交換樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附試驗(yàn)，5種樹脂的物理參數(shù)見表1。

表1 離子交換樹脂的物理性質(zhì)［11，12］Table 1 Physical properties of ion exchange resin

1.3.3 供試品試液的制備 取一定量藤黃果粗提物置于三角瓶中，加入一定量的水，超聲提取20 min，過濾，其中的羥基檸檬酸含量待測。

1.3.4 高效液相色譜法對羥基檸檬酸含量及純度的測定

（1）色譜條件：色譜柱：依利特 Zorbax C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：0.1%磷酸水—甲醇（99∶1），等度洗脫；體積流量0.8 m L／min；檢測波長210 mm；柱溫30℃；進(jìn)樣體積10μL。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取羥基檸檬酸對照品10.0 mg，置于1 m L容量瓶中，加入少量超純水，搖勻使其充分溶解，再定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為10 mg／m L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩Ａ咳×u基檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，用超純水逐級稀釋成質(zhì)量濃度為1.0，0.5，0.2，0.1，0.01，0.005 mg／m L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用0.45μm微孔濾膜過濾后，分別進(jìn)樣，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3次，測定峰面積積分值。以羥基檸檬酸質(zhì)量濃度對峰面積平均值進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝637.47 X＋1.831 7（R2＝0.999 9）在5～1 000μg／m L處與峰面積呈良好線性相關(guān)。

1.3.5 靜態(tài)吸附與洗脫研究

（1）靜態(tài)吸附試驗(yàn)篩選樹脂：① 吸附率的測定［13］：分別稱取2 g（濕重）預(yù)處理好的 D315、D201、D301、335、HZ－202樹脂，置于5個(gè)100 m L具塞錐形瓶中，加入質(zhì)量濃度為2.82 mg／m L的羥基檸檬酸溶液20 m L，靜置過夜后取上清液測定羥基檸檬酸的質(zhì)量濃度，按式（1）、（2）計(jì)算羥基檸檬酸的吸附量和吸附率。

式中：

q——吸附容量，mg／g；

E——吸附率，%；

C0——吸附前樣液中羥基檸檬酸質(zhì)量濃度，mg／m L；

C1——吸附后樣液中羥基檸檬酸質(zhì)量濃度，mg／m L；

V1——加入粗提液體積，m L；

W——樹脂質(zhì)量，g。

② 解吸率的測定［11］：取上述靜態(tài)吸附飽和后的樹脂，分別置于5個(gè)100 m L具塞錐形瓶中，用蒸餾水洗滌后，分別加入1 mol／L NaCl溶液20 m L，靜置過夜后取上清液測定羥基檸檬酸的質(zhì)量濃度，按式（3）計(jì)算樹脂的解吸率。

式中：

E＇——解吸率，%；

C——解吸后樣液中羥基檸檬酸質(zhì)量濃度，mg／m L；

C0——吸附前樣液中羥基檸檬酸質(zhì)量濃度，mg／m L；

C1——吸附后樣液中的羥基檸檬酸質(zhì)量濃度，mg／m L；

V2——加入洗脫液體積，m L；

V1——加入粗提液體積，m L。

（2）吸附動力學(xué)曲線：在100 m L具塞錐形瓶中，加入2 g（濕重）預(yù)處理好的D201樹脂和濃度為2.82 mg／m L的羥基檸檬酸溶 液 20 m L，吸取 15，30，45，60，120，240，360 min時(shí)的上清液，測定羥基檸檬酸的質(zhì)量濃度，按式（1）計(jì)算羥基檸檬酸的吸附容量并繪制靜態(tài)吸附曲線。

（3）解吸動力學(xué)曲線：在100 m L具塞錐形瓶中，加入2 g（濕重）吸附羥基檸檬酸的D201樹脂，用蒸餾水洗滌后，再加入1 mol／L的 NaCl溶液20 m L，吸取15，30，45，60，120，240，360 min時(shí)的上清液，測定羥基檸檬酸的質(zhì)量濃度，按照式（3）計(jì)算樹脂的解吸率并繪制靜態(tài)解吸曲線。

（4）靜態(tài)吸附試驗(yàn)選擇最優(yōu)p H值：分別稱取5份2 g（濕重）預(yù)處理好的D201樹脂，置于5個(gè)100 m L具塞錐形瓶中，加入質(zhì)量濃度為2.82 mg／m L的羥基檸檬酸溶液20 m L，p H值分別調(diào)為2，3，5，7，9，測定上清液中羥基檸檬酸的質(zhì)量濃度，按式（1）計(jì)算飽和吸附容量。

（5）解吸溶液的選擇：在8個(gè)100 m L具塞錐形瓶中，加入2 g（濕重）吸附羥基檸檬酸的D201樹脂，用蒸餾水洗滌后，分別加入1 mol／L NaOH、NaCl、KOH、氨水、醋酸、磷酸、鹽酸、硫酸溶液20 m L，取上清液測定羥基檸檬酸的質(zhì)量濃度，按式（3）計(jì)算樹脂的解吸率。

（6）解吸液濃度的選擇：分別稱取2 g（濕重）吸附羥基檸檬酸的D201樹脂，置于10個(gè)100 m L具塞錐形瓶中，用蒸餾水洗滌后，分別加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mol／L NaCl水溶液20 m L，取上清液測定羥基檸檬酸的質(zhì)量濃度，按照式（3）計(jì)算樹脂的解吸率。

1.3.6 動態(tài)吸附與洗脫研究

（1）上樣濃度對樹脂吸附的影響：將上樣濃度分別調(diào)為3.12 mg／m L和6.81 mg／m L，均以1.0 m L／min的流速通過高徑比為11（樹脂20 g）的樹脂。每10 m L收集一管洗脫液，測每管羥基檸檬酸含量，考察上樣濃度對樹脂吸附性能的影響。

（2）上樣流速對樹脂吸附的影響：將上樣濃度調(diào)為3.12 mg／m L，分別以1.0，3.0 m L／min的流速通過高徑比為11（樹脂20 g）的樹脂。每10 m L收集一管洗脫液，測每管羥基檸檬酸含量，考察上樣流速對樹脂吸附性能的影響。

（3）解吸液濃度對樹脂洗脫的影響：分別配制0.4，1.0 mol／L的 NaCl溶液作為解吸液，以1.0 m L／min的流速分別洗脫吸附羥基檸檬酸的樹脂，每10 m L收集一管洗脫液，測每管羥基檸檬酸含量，考察解吸液濃度對樹脂洗脫的影響。

（4）解吸液流速對樹脂洗脫的影響：以0.4 mol／L的NaCl溶液作為洗脫液，分別采用1.0，3.0 m L／min的流速洗脫吸附羥基檸檬酸的樹脂，每10 m L收集一管洗脫液，測每管羥基檸檬酸含量，考察解吸液流速對樹脂洗脫的影響。

1.3.7 羥基檸檬酸的純化 經(jīng)D201樹脂吸附與解吸后，將解吸液收集，并以1 m L／min的流速通過預(yù)處理好的001×7陽離子交換樹脂柱，去除解吸液中的Na＋雜質(zhì)離子。收集解吸液，旋轉(zhuǎn)濃縮至一定體積后，真空冷凍干燥，得到較純的羥基檸檬酸樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 靜態(tài)吸附與洗脫結(jié)果分析

2.1.1 離子交換樹脂的選擇 由圖2可知，D201對羥基檸檬酸的吸附率和解吸率均高于其他樹脂。D201樹脂對羥基檸檬酸的吸附和解吸率最高的原因可能有兩個(gè)：①D201樹脂為強(qiáng)堿性陰離子樹脂，羥基檸檬酸根離子容易與樹脂上帶有的陰離子進(jìn)行交換，并且該樹脂具有交換速度快、交換容量大等特點(diǎn)；②D201樹脂為大孔樹脂，羥基檸檬酸較易進(jìn)入到樹脂內(nèi)部而發(fā)生交換。因此選擇D201樹脂做后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 各樹脂對羥基檸檬酸靜態(tài)吸附率、解吸率的比較Figure 2 Adsorption and elution of HCA by different resins

2.1.2 離子交換樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線 評價(jià)樹脂的一個(gè)重要指標(biāo)是樹脂的吸附速率，所選的樹脂不僅需要有高的吸附量，而且需要有快速達(dá)到吸附平衡的能力［10］。由圖3可知，D201對羥基檸檬酸為快速平衡型，在2 h內(nèi)基本達(dá)到平衡，其飽和吸附量為27.325 mg／g。

圖3 靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線Figure 3 Static adsorption kinetic of D201 resin for HCA

2.1.3 離子交換樹脂靜態(tài)解吸動力學(xué)曲線 由圖4可知，D201樹脂在90 min左右就即將達(dá)到最高解吸率，解吸基本完全的時(shí)間為2 h，此時(shí)的靜態(tài)解吸率為59.7%。

圖4 靜態(tài)解吸動力學(xué)曲線Figure 4 Static desorption kinetic of D201 resin for HCA

2.1.4 上樣液p H值的選擇 由圖5可知，在p H值較低的情況下，D201樹脂對羥基檸檬酸的吸附容量較低；隨著p H值的升高，D201樹脂對羥基檸檬酸的吸附容量逐漸增加，當(dāng)p H值為5時(shí)，其吸附容量最大；而隨著p H值的進(jìn)一步升高，樹脂的吸附容量逐漸降低。原因可能是，當(dāng)p H值為5時(shí)，羥基檸檬酸的酸根離子較多，增大電荷，從而有利于樹脂對羥基檸檬酸的吸附。

圖5 上樣液p H值對D201樹脂吸附容量的影響Figure 5 Effect of p H on adsorption capacity of D201 resin

2.1.5 解吸溶劑的篩選 由圖6可知，磷酸、鹽酸、硫酸這3種酸對HCA的解吸率均較高，NaCl溶液也有一定的解吸率。但如果選擇磷酸、鹽酸、硫酸溶液作為洗脫劑，在后續(xù)操作時(shí)酸根除去難度大。因此選擇NaCl溶液進(jìn)行洗脫，再將洗脫液通過酸性陽離子交換樹脂得到羥基檸檬酸，以達(dá)到脫鹽純化效果。該方法簡單，可操作性強(qiáng)。所以，綜合考慮，選擇NaCl溶液作為解吸溶劑。

圖6 不同解析溶劑解析效果比較Figure 6 Effect of different of eluent by D201 resin

2.1.6 解吸劑濃度的篩選 由圖7可知，在低濃度的NaCl溶液對羥基檸檬酸的解吸率不高；隨著NaCl溶液濃度的不斷增高，在濃度為0.4 mol／L時(shí)解吸率達(dá)到最高，為83.24%；繼續(xù)增大NaCl溶液的濃度，解吸率反而減小，因此選擇0.4 mol／L NaCl溶液作為解吸劑。

圖7 洗脫液濃度對羥基檸檬酸洗脫率的影響Figure 7 Effect of concentration of eluent by D201 resin

通過靜態(tài)吸附與洗脫研究，得知D201離子交換樹脂對羥基檸檬酸的靜態(tài)吸附飽和容量為27.325 mg／g，靜態(tài)解吸率為83.24%。D201樹脂靜態(tài)吸附的最佳條件為吸附時(shí)間2 h，上樣液p H值5；解吸的最佳條件為選用0.4 mol／L NaCl溶液為解吸劑，解吸時(shí)間2 h。

2.2 動態(tài)吸附與洗脫研究結(jié)果分析

2.2.1 上樣液濃度的選擇 由圖8可知，當(dāng)上樣液濃度為3.12 mg／m L時(shí)，羥基檸檬酸在D201樹脂上的穿透體積為130 m L，穿 透 容 量 為 45.63 mg／g；當(dāng) 上 樣 液 濃 度 為6.81 mg／m L時(shí)，羥基檸檬酸在D201樹脂上的穿透體積為60 m L，穿透容量為35.91 mg／g。由此可知，上樣液濃度低有利于樹脂交換。離子交換樹脂有一定的交換容量，若上樣液濃度大，樹脂與吸附離子間不能夠完全交換，樹脂很容易出現(xiàn)滲漏。因此選擇3.12 mg／m L做為后續(xù)試驗(yàn)的上樣濃度。

2.2.2 上樣液流速的選擇 由圖9可知，當(dāng)上樣液流速為1 m L／min時(shí)，羥基檸檬酸在D201樹脂上的穿透體積為130 m L，穿透容量為45.63 mg／g；流速為3 m L／min時(shí)，羥基檸檬酸在D201樹脂上的穿透體積為50 m L，穿透容量為17.8 mg／g。由此可知，較小的流速利于樹脂的吸附。若流速過大，上樣液與樹脂之間的接觸時(shí)間短，會導(dǎo)致樹脂來不及吸附上樣液就發(fā)生滲漏。因此本試驗(yàn)選擇上樣液流速為1 m L／min做后續(xù)試驗(yàn)。

圖9 上樣液流速對樹脂吸附的影響Figure 9 Effect of sample rate on D201 resin adsorption of HCA

2.2.3 洗脫液濃度的選擇 由圖10可知，當(dāng)NaCl溶液濃度為0.4 mol／L，即洗脫液濃度較小時(shí)，出峰較快，洗脫峰型較集中，洗脫峰值較高；而當(dāng)NaCl溶液的濃度為1 mol／L，即洗脫液濃度較大時(shí)，峰型分布不均勻，出峰較慢，洗脫峰值較低。因此選擇濃度為0.4 mol／L NaCl溶液來洗脫羥基檸檬酸。

圖10 不同濃度洗脫液對羥基檸檬酸的洗脫Figure 10 Effect of eluent concentration on D201 resin elution of HCA

2.2.4 洗脫液流速的選擇 由圖11可知，不同的洗脫流速對洗脫峰型并沒有太大影響，但選擇較小的洗脫液流速，洗脫液有較充分的時(shí)間與樹脂交換，羥基檸檬酸的洗脫峰值較高。因此選擇1.0 m L／min的洗脫液流速較為合適。

圖11 不同洗脫液速度對羥基檸檬酸的洗脫Figure 11 Effect of eluent rate on D201 resin elution of HCA

通過動態(tài)吸附和洗脫研究，得知當(dāng)上樣液濃度3.12 mg／m L、上樣液流速1 m L／min時(shí)樹脂對羥基檸檬酸的吸附較完全；當(dāng)洗脫液NaCl濃度為0.4 mol／L、洗脫液流速為1 m L／min時(shí)，對羥基檸檬酸的解吸效果較好，洗脫峰值較高。

2.3 離子交換樹脂純化后羥基檸檬酸純度

羥基檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)超純水溶解，依1.3.4（1）的方法進(jìn)行HPLC分析，如圖12所示，保留時(shí)間5.280 min的為羥基檸檬酸，純度大于98%。

藤黃果粗提物水溶液，依1.3.4（1）的方法進(jìn)行 HPLC分析，如圖13（a）所示，經(jīng)保留時(shí)間及峰高增高法定性為羥基檸檬酸，通過外標(biāo)定量法，計(jì)算得到粗產(chǎn)品中羥基檸檬酸和含量為40.3%。

經(jīng)D201及001（7離子交換樹脂純化后的樣品收集，依1.3.4（1）的方法進(jìn)行 HPLC分析，如圖13（b）所示，經(jīng)外標(biāo)定量法，計(jì)算得到經(jīng)離子交換樹脂純化后羥基檸檬酸的純度為91.3%。

圖12 羥基檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Figure 12 Chromatogram of HCA standard

圖13 羥基檸檬酸純化前后色譜圖Figure 13 Chromatogram of unpurified and purified of HCA

3 結(jié)論

通過5種型號陰離子交換樹脂靜態(tài)吸附和解析的比較，發(fā)現(xiàn)D201型離子交換樹脂對羥基檸檬酸的吸附量大、吸附率高，并易解吸，具有高的吸附率和解析率，適用于羥基檸檬酸的純化研究。D201樹脂純化羥基檸檬酸的最佳工藝條件為：上樣液 p H 5，上樣液質(zhì)量濃度3.12 mg／m L，洗脫液0.4 mol／L的 NaCl溶 液，上 樣 流 速 與 洗 脫 流 速 均 為1 m L／min。結(jié)果顯示：經(jīng)D201型離子交換樹脂純化后羥基檸檬酸純度由40.3%提高到了91.3%，得率為10.8%。表明，D201樹脂對羥基檸檬酸的分離純化具有良好的選擇性和應(yīng)用前景。

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