血必凈對膿毒癥大鼠T細胞凋亡和PD—1/PD—L1表達的影響

摘要：目的 探討血必凈對膿毒癥T細胞凋亡和PD-1/PD-L1表達的影響。方法 選用SD大鼠60只，采用經(jīng)典盲腸結扎穿孔術（cecal ligation and puncture， CLP）復制膿毒癥模型，設立正常組、假手術組、CLP模型組、CLP模型加血必凈組4組，CLP模型加血必凈組大鼠于CLP術后腹腔注射血必凈。流式細胞儀檢測上述4組小鼠術后12h、24h、36h及48h胸腺T細胞凋亡、胸腺T細胞PD-1和單核細胞PD-L1表達。結果 胸腺T細胞凋亡、胸腺T細胞PD-1和單核細胞PD-L1表達在正常組與假手術組比較無統(tǒng)計學差異（P>0.05），CLP模型組自12h起各時間點脾淋巴細胞凋亡水平、胸腺T細胞PD-1和單核細胞PD-L1表達均較假手術組明顯升高（P<0.05）。且各時點CLP模型加血必凈組脾淋巴細胞凋亡水平、胸腺T細胞PD-1和單核細胞PD-L1表達均較相應時點CLP組水平下降（P<0.05）。結論 血必凈可以降低膿毒癥T細胞凋亡及PD-1/PD-L1表達。

關鍵詞：膿毒癥；血必凈；T細胞凋亡；PD-1/PD-L1

膿毒癥患者后期存在免疫抑制，PD-1是新型免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，PD-1與其配體之一PD-L1結合可通過負性調(diào)節(jié)T細胞功能參與多種疾病的免疫調(diào)節(jié)。本課題擬探討血必凈對膿毒癥大鼠T細胞凋亡和PD-1/PD-L1表達的影響，探討血必凈在膿毒癥免疫抑制期的調(diào)節(jié)作用及可能機制。

1資料與方法

1.1實驗動物及分組 SD大鼠60只，體重180～220g，適應性飼養(yǎng)1～2w，實驗前禁食12 h。按隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組（n=6）、假手術組（n=6）、模型組（n=24）、血必凈組（n=24）。模型組與血必凈組分別于術后12h、24h、36h及48h各處死6只并獲取標本。

1.2方法 按照大鼠盲腸結扎穿孔模型（CLP）制作方法制作膿毒血癥模型。模型制作前禁食12h，10%水合氯醛400mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，腹正中切口2cm， 在盲腸根部用4號線結扎盲腸，用14G套管針將盲腸貫通穿孔，還納腸管于腹腔，間斷縫合腹壁。術畢立即皮下注射10 m1生理鹽水抗休克。假手術組只暴露盲腸后縫合皮膚，經(jīng)陰莖背靜脈注射生理鹽水4 ml/kg。血必凈組在CLP基礎上經(jīng)陰莖背靜脈注入血必凈注射液4 mg/kg。脾淋巴細胞凋亡采用原位末端凋亡檢測（TUNEL）法。流式細胞儀檢測胸腺T細胞PD-1和單核細胞PD-L1表達。FACS Calibur流式細胞儀系美國BD公司產(chǎn)品；血必凈注射液由天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)（國藥準字Z20040033）。

1.3統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)以（x±s）表示，統(tǒng)計處理采用SPSS16.0軟件進行分析。同一時點組間比較用 t 檢驗，組間比較用q檢驗，P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有非常顯著性。

2結果

2.1脾TUNEL染色細胞陽性率比較 對照組與假手術組之間比較無統(tǒng)計學差異（P=1.000）。CLP組自12h起各時間點脾淋巴細胞凋亡水平均較假手術組明顯升高（P<0.05）。CLP加血必凈組各時點脾淋巴細胞凋亡水平雖亦有所升高，但僅24h組與假手術組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），且各時點CLP加血必凈組脾淋巴細胞凋亡水平均較相應時點CLP組水平下降，均具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），見表1。

2.2各組動物脾組織中CD3+細胞比例比較 對照組與假手術組之間脾組織中CD3+細胞比例無統(tǒng)計學差異（P=0.266）。自12h起各時點膿毒癥組脾組織中CD3+細胞比例均較假手術組明顯降低（P<0.05）。中藥組CD3+細胞比例除12h低于假手術組外（P<0.05），其余各時點均與假手術組無明顯差異。且中藥組s自12h起各時點膿毒癥組脾組織中CD3+細胞比例較相應時點膿毒癥組水平升高（P<0.05），見表2。

2.3各組動物脾組織中CD3+細胞PD-1及單核細胞 PD-L1表達比較 對照組與假手術組之間脾組織中CD3+細胞PD-1/及單核細胞PD-L1表達無統(tǒng)計學差異（P=0.266）。自12h起各時點脾組織中CD3+細胞PD-1/及單核細胞PD-L1表達均較假手術組明顯降低（P<0.05）。血必凈組脾組織中CD3+細胞PD-1/及單核細胞PD-L1表達除12h低于假手術組外（P<0.05），其余各時點均與假手術組無明顯差異。且血必凈組自12h起各時點膿毒癥組脾組織中CD3+細胞PD-1/ PD-L1表達較相應時點膿毒癥組水平升高（P<0.05），見表3，表4。

3討論

膿毒癥晚期，機體表現(xiàn)為免疫抑制，淋巴細胞大量凋亡導致的淋巴細胞數(shù)減少可能是造成這一表現(xiàn)的重要因素。Hotchkiss等[1]報道死于膿毒癥的患者存在明顯的低淋巴細胞血癥，脾臟和淋巴結中的淋巴細胞凋亡明顯增加[2]。 這提示我們，糾正淋巴細胞的異常凋亡應成為治療膿毒癥新的著眼點。

機體免疫系統(tǒng)存在一群共抑制分子，其主要功能是抑制從中樞免疫耐受機制中逃逸的自身反應細胞和接受抗原刺激后免疫細胞的過度反應，以維持機體免疫活化和免疫耐受之間的平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。程序性死亡受體-1（programmed death 1，PD-1）是新型免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，為CD28家族成員，能夠與B7家族分子PD-L1或PD-L2結合。PD-1可表達于T細胞、B細胞、髓系細胞和胸腺細胞。PD-1與其配體之一PD-L1結合可傳遞負性調(diào)控信號，導致病原特異性T細胞的誘導凋亡和免疫無能?，F(xiàn)有研究提示， PD-1/PD-L1途徑在慢性病毒感染、腫瘤免疫、自身免疫性疾病等的免疫調(diào)節(jié)方面有著廣泛的作用[3-7]。

膿毒癥的免疫抑制期與慢性病毒感染、腫瘤、自身免疫性疾病的免疫耐受/抑制，具有一定相似性，本研究結果表明膿毒癥確實存在T細胞凋亡增多的現(xiàn)象， PD-1/PD-L1表達增高的情況，證實了這一推測。

中醫(yī)學認為膿毒癥屬\"傷寒\"、\"溫病\"學的范疇，運用傷寒、溫病的理論研究膿毒癥非常合理，這不僅體現(xiàn)在膿毒癥的臨床特點與傷寒、溫病的臨床特點相似，更重要的是兩者之間研究的對象一致。中醫(yī)學在此類疾病方面積累了豐富的臨床經(jīng)驗，整個中醫(yī)學的發(fā)展史實際上就是認識治療感染性疾病即膿毒癥的歷史[8]。中西醫(yī)結合是治療膿毒癥的重要措施[9]。

血必凈注射液是我國著名中西醫(yī)結合危重病學家王今達教授歷30余年臨床研究，目前已廣泛應用于膿毒癥治療的中藥二類新藥（國藥準字J20040033），主要成分為赤芍、川芎、丹參、紅花和當歸等。該藥具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡、潰散毒邪的作用，可以拮抗內(nèi)毒素，并抑制內(nèi)源性炎性介質(zhì)（TNF-α）的失控釋放，與抗生素并用治療膿毒癥具有較好的臨床療效[10]。

本次研究表明血必凈可以降低膿毒癥T細胞凋亡，影響PD-1/PD-L1表達。說明PD-1/PD-L1可能是血必凈調(diào)節(jié)膿毒癥晚期免疫抑制狀態(tài)，降低T細胞凋亡的重要靶點。

參考文獻：

[1]Hotchkis RS，Swanson PE，F(xiàn)reeman BD，et al.Apoptotic cell death in patients with sepsis， shock， and multiple organ dysfunction[J].Crit Care Med，1999，27（7）：1230-1251.

[2]Hotchkis RS，Tinsley KW ，Swanson PE，et al.Prevention of lymphocyte cell death in sepsis improves survival in mice[J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（25）：14541-14546.

[3]Zhang JY，Zhang Z，Wang X，et al.PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+T cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors[J].Blood，2007，109（11）：4671-4678.

[4]Maier H，Isogawa M，F(xiàn)reeman GJ，et al.PD-1：PD-L1 interactions contribute to the functional suppression of virus-specific CD8+T lymphocytes in the liver[J].J Immunol，2007，178（5）：2714-2720.

[5]Cho HY， Choi EK， Lee SW， et al.Programmed death-1 receptor negatively regulates LPS-mediated IL-12 production and differentiation of murine macrophage RAW264.7 cells[J].Immunol Lett，2009，127：39-47.

[6]Yao S， Wang S， Zhu Y， et al.PD-1 on dendritic cells impedes innate immunity against bacterial infection[J].Blood，2009，113（23）：5811-5818.

[7]Huang X， Venet F， Wang Y L， et al.PD-1 expression by macrophages plays a pathologic role in altering microbial clearance and the innate inflammatory response to sepsis[J].PNAS，2009，106（15）：6303-6308.

[8]劉清泉，籃海濤.中醫(yī)對膿毒癥的認識及辨證體系的研究[J].中華中西醫(yī)臨床雜志，2004，4（3）：261-264.

[9]王今達.膿毒癥：感染性MODS的預防[J].中國危重病急救醫(yī)學，1999，11：453.

[10]張畔，曹書華，崔克亮，等.血必凈對多臟器功能障礙綜合征單核細胞HLA-DR表達影響的研究[J].中國中西醫(yī)結合急救雜志，2002，9：21，23，455.

編輯/申磊