乙型肝炎患者血清抗黑素細(xì)胞抗體檢測(cè)及與白癜風(fēng)發(fā)病相關(guān)性的分析

摘要：目的 檢測(cè)乙型肝炎患者血清中抗黑素細(xì)胞抗體水平，對(duì)其與乙型肝炎患者并發(fā)白癜風(fēng)的相關(guān)性進(jìn)行分析。方法 收集經(jīng)過(guò)乙肝五項(xiàng)檢測(cè)的血清標(biāo)本88份，根據(jù)乙肝五項(xiàng)結(jié)果模式分為肝炎組（48例）和非肝炎組（40例），肝炎組標(biāo)本包括HbsAg、HbeAg、HbcAb陽(yáng)性（大三陽(yáng)）8例，HbsAg、HbeAb、HbcAb陽(yáng)性（小三陽(yáng)）40例，非肝炎組標(biāo)本包括HbsAb、HbeAb、HbcAb三抗體陽(yáng)性（2，4，5）16例，HbsAb陽(yáng)性（2）16例，全陰性（-）8例，采用ELISA法檢測(cè)抗人黑素細(xì)胞抗體水平，將組間及組內(nèi)標(biāo)本的抗體滴度水平，抗體陽(yáng)性率進(jìn)行比較，并用SPSS13.0軟件分析，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異非常顯著。結(jié)果 肝炎組大三陽(yáng)、小三陽(yáng)抗黑素細(xì)胞抗體陽(yáng)性率分別為87%（7/8）、85%（34/40），非肝炎組2，4，5陽(yáng)性、2陽(yáng)性、全陰性標(biāo)本為0%（0/16）、0%（0/16）、0%（0/8）；肝炎組大三陽(yáng)、小三陽(yáng)陽(yáng)性標(biāo)本抗體OD均值為1.945±0.652、1.834±0.867，非肝炎組標(biāo)本OD均值為0.166±0.068、0.196±0.058、0.263±0.034，經(jīng)比較肝炎組與非肝炎組患者在抗體陽(yáng)性率和抗體滴度水平上差異非常顯著（P<0.01），肝炎組內(nèi)及非肝炎組內(nèi)患者兩項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著（P>0.05）。并發(fā)白癜風(fēng)的乙肝患者高滴度抗黑素細(xì)胞抗體陽(yáng)性率100%。結(jié)論 大部分乙型肝炎患者血清內(nèi)存在高滴度的抗黑素細(xì)胞抗體，高抗體水平可能和乙肝患者繼發(fā)白癜風(fēng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：乙肝；白癜風(fēng)；抗黑素細(xì)胞抗體；ELISA

白癜風(fēng)是一種局限性或泛發(fā)性色素脫失性皮膚病，臨床上可能和其他器官特異性自身免疫性疾病有關(guān)，如自身免疫甲狀腺炎、自身免疫性多內(nèi)分泌腺綜合征I型及乙型肝炎等[1]。該病病因尚不清楚，包括自身免疫學(xué)說(shuō)、黑素細(xì)胞自身破壞凋亡學(xué)說(shuō)、神經(jīng)化學(xué)因子學(xué)說(shuō)等[2-4]，近年來(lái)更多學(xué)者支持白癜風(fēng)的發(fā)病與自身免疫異常有關(guān)，患者體內(nèi)存在細(xì)胞免疫和體液免疫紊亂：前者表現(xiàn)為CD4陽(yáng)性T細(xì)胞水平下降，CD8陽(yáng)性T細(xì)胞水平上升，CD4/CD8比值下降[5]，白癜風(fēng)白斑區(qū)邊緣處有大量浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞等[6]；后者表現(xiàn)為患者體內(nèi)會(huì)有抗黑素細(xì)胞抗體等多種自身抗體出現(xiàn)，而且這些抗體水平可能和白癜風(fēng)的活動(dòng)性有關(guān)[7]。在本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)白癜風(fēng)患者血清抗黑素細(xì)胞抗體的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，擁有高滴度抗體水平的白癜風(fēng)患者均為HbsAg陽(yáng)性患者，是病例巧合還是普遍規(guī)律尚未明確，國(guó)內(nèi)外以往文獻(xiàn)也未發(fā)現(xiàn)有類(lèi)似報(bào)道，所以本研究留取本院乙肝五項(xiàng)體檢結(jié)果不同模式的血清標(biāo)本88例，其中乙肝患者標(biāo)本48例，9例合并白癜風(fēng)，非乙肝患者標(biāo)本40例，用ELISA法檢測(cè)了抗黑素細(xì)胞抗體水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 北京市空軍總醫(yī)院2013年10月中接受\"乙肝五項(xiàng)\"體檢的患者血清，其中乙肝患者標(biāo)本48例，包括HbsAg、HbeAg、HbcAb陽(yáng)性（大三陽(yáng)1，3，5）8例，HbsAg、HbeAb、HbcAb陽(yáng)性（小三陽(yáng)1，4，5）40例，非乙肝患者標(biāo)本40例，包括HbsAb、HbeAb、HbcAb三抗體陽(yáng)性（2，4，5）16例，HbsAb陽(yáng)性（2）16例，全陰性（-）8例，年齡分布在18～55歲。標(biāo)本留取方法為當(dāng)日標(biāo)本檢測(cè)完畢后，挑取目標(biāo)血清200μl于無(wú)菌ELISA板管中，-20℃保存?zhèn)溆茫?個(gè)月內(nèi)完成檢測(cè)。

1.2試劑及儀器

1.2.1抗人體黑素細(xì)胞抗體ELISA試劑盒 北京凱諾春天生物試劑有限公司提供，包括標(biāo)準(zhǔn)品6個(gè)，樣本稀釋液6ml，HRP標(biāo)記物 10ml，20x洗滌緩沖液25ml，底物A，B各6ml，終止液6ml；

1.2.2冰箱 中國(guó)海爾公司生產(chǎn)，SC-316；

1.2.3離心機(jī) 中國(guó)河北白洋離心機(jī)廠生產(chǎn)，B600A；

1.2.4 酶標(biāo)儀 美國(guó)，Bio-RAD公司；

1.2.5 37℃恒溫箱；

1.2.6全自動(dòng)洗板機(jī)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 待檢血清室溫自然融化，ELISA試劑盒于室溫平衡30min，洗滌緩沖液按照說(shuō)明書(shū)配制。

1.3.2實(shí)驗(yàn)操作步驟 嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。①設(shè)置樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔分布表（見(jiàn)表1）。②加樣：標(biāo)本區(qū)先加待測(cè)樣本10ul，再加樣本稀釋液40ul；標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50ul后每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記物100ul，空白孔不加，封板膜封孔，震動(dòng)1min，37℃恒溫箱溫育60min。③洗板機(jī)洗板5次。④每孔加入底物A，B各50ul，37℃孵育15min。⑤每孔加入終止液50ul，15min內(nèi)，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)本OD值大于全陰性對(duì)照組OD均值的2.1倍。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間及組內(nèi)陽(yáng)性率的比較采用÷2檢驗(yàn)，抗體的定量用x±s表示，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異非常顯著。

2結(jié)果

乙型肝炎患者血清抗黑素細(xì)胞抗體OD值和陽(yáng)性率結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。由表中可見(jiàn)乙型肝炎患者組大三陽(yáng)、小三陽(yáng)及非乙型肝炎患者組2，4，5陽(yáng)性、2陽(yáng)性、全陰性標(biāo)本患者抗體的陽(yáng)性率分別為87%（7/8）、85%（34/40），0%（0/16）、0%（0/16）、0%（0/8），OD均值為1.945±0.652、1.834±0.867、0.166±0.068、0.196±0.058、0.263±0.034；經(jīng)比較，肝炎組大三陽(yáng)、小三陽(yáng)患者標(biāo)本抗黑素細(xì)胞抗體陽(yáng)性率和吸光度均值明顯高于全陰性對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著（P<0.01）見(jiàn)圖1；非肝炎組2，4，5陽(yáng)性、2陽(yáng)性患者標(biāo)本與全陰性對(duì)照組比較差異不顯著（P>0.05）。

圖1 肝炎組和全陰性組吸光度值比較

肝炎組內(nèi)大三陽(yáng)標(biāo)本在抗體陽(yáng)性率和OD均值上略高于小三陽(yáng)標(biāo)本，但經(jīng)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）（表2）；肝炎組合并白癜風(fēng)的患者抗黑素細(xì)胞抗體的陽(yáng)性率為100%（表3）。

3討論

白癜風(fēng)是由于某種原因使位于表皮基底層的黑素細(xì)胞崩解、破潰，局部黑素缺失而出現(xiàn)白斑，臨床易診難治，給患者帶來(lái)很大痛苦，發(fā)病率2～3%且近年有增加趨勢(shì)。臨床上很多白癜風(fēng)患者合并有其他一些自身免疫病，如乙型肝炎，臨床上有部分乙肝患者患病數(shù)年后會(huì)出現(xiàn)白癜風(fēng)的癥狀而且難以控制，我們前期在對(duì)136例白癜風(fēng)患者血清抗黑素細(xì)胞抗體的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，擁有高滴度抗黑素細(xì)胞抗體的白癜風(fēng)患者并不多，只有6.6%（9/136）[8]，這些高滴度的患者均為HbsAg陽(yáng)性，是巧合還是普遍規(guī)律，是乙肝患者并發(fā)白癜風(fēng)之后引起了抗黑素細(xì)胞抗體急劇升高，還是乙肝患者普遍存在高滴度的抗體，這兩種疾病之間在發(fā)病機(jī)制上是否有某種內(nèi)在必然的聯(lián)系目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本文留取了88例乙肝五項(xiàng)不同模式的體檢血清，其中乙肝患者48例，其中包括并發(fā)白癜風(fēng)的9例，非乙肝患者40例，其中8例為無(wú)任何皮膚性疾病的全陰性標(biāo)本，用ELISA方法對(duì)血清中的抗黑素細(xì)胞抗體進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果大多數(shù)乙肝患者均具有高滴度的抗黑素細(xì)胞抗體，大三陽(yáng)標(biāo)本陽(yáng)性率達(dá)87.5%，小三陽(yáng)為85%，平均為86.25%，非肝炎組2，4，5抗體陽(yáng)性和2陽(yáng)性標(biāo)本及全陰性標(biāo)本高滴度抗體陽(yáng)性率均為0%，乙肝患者組與陰性組陽(yáng)性率比較有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在抗體檢測(cè)OD均值上肝炎組標(biāo)本大三陽(yáng)略高于小三陽(yáng)，陽(yáng)性標(biāo)本OD均值達(dá)陰性對(duì)照標(biāo)本均值的7倍以上，而非肝炎組兩種模式的標(biāo)本與全陰性組標(biāo)本比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，甚至出現(xiàn)抗體OD均值低于陰性標(biāo)本現(xiàn)象；另外并發(fā)白癜風(fēng)的乙肝患者血清中高滴度抗體陽(yáng)性率100%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高滴度的抗黑素細(xì)胞抗體和乙肝病毒的感染及乙肝病毒的活動(dòng)度密切相關(guān)，而且高滴度的抗體不是在白癜風(fēng)發(fā)生之后出現(xiàn)，而是在發(fā)生前即已在體內(nèi)存在。

白癜風(fēng)的致病機(jī)制尚不明了，目前多數(shù)學(xué)者支持白癜風(fēng)的發(fā)病與患者體內(nèi)自身免疫紊亂有關(guān)，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。早年對(duì)白癜風(fēng)患者的體液免疫研究指出白癜風(fēng)患者體內(nèi)普遍存在抗黑素細(xì)胞抗體，抗體的滴度與疾病的活動(dòng)度和類(lèi)型密切相關(guān)；血清內(nèi)的循環(huán)抗黑素細(xì)胞抗體可以通過(guò)補(bǔ)體激活和抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用破壞體外培養(yǎng)的人黑色素細(xì)胞[8]，本文研究結(jié)果顯示絕大部分乙肝患者體內(nèi)存在高滴度的抗黑素細(xì)胞抗體，然而并發(fā)白癜風(fēng)的患者只是個(gè)例，筆者認(rèn)為抗黑素細(xì)胞抗體的滴度并非為白癜風(fēng)進(jìn)展程度的反應(yīng)，是否為導(dǎo)致黑素細(xì)胞破壞的直接因素有待于進(jìn)一步研究。

隨著近年來(lái)的研究，白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制和乙型肝炎似乎有相似之處。乙肝的發(fā)病并不是HBV感染后直接導(dǎo)致的細(xì)胞毒作用的結(jié)果，而是由T細(xì)胞毒反應(yīng)所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)誘發(fā)肝臟的免疫病理?yè)p傷[9]。目前白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制也更傾向于細(xì)胞免疫反應(yīng)的結(jié)果，CD8+的特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)是自身免疫性白癜風(fēng)發(fā)病的一個(gè)重要效應(yīng)機(jī)制[10]，CD8+CTL能夠特異性結(jié)合人正常黑素細(xì)胞表面的MART-1蛋白，通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶破壞黑素細(xì)胞。MART-1為人類(lèi)分化抗原，表達(dá)與幾乎所有黑色素瘤細(xì)胞和黑色素細(xì)胞，而在正常組織卻不表達(dá)，特異性 CTL有識(shí)別MART-1的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[11]，所以由此推論，持續(xù)的HBV復(fù)制刺激了機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，CD8+CTL在破壞肝細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)破壞人的黑素細(xì)胞，引起部分乙肝患者發(fā)生白癜風(fēng)。至于多數(shù)乙肝患者體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的抗黑素細(xì)胞抗體的原因和機(jī)制筆者認(rèn)為可能是黑素細(xì)胞在持續(xù)的細(xì)胞免疫紊亂和攻擊的狀態(tài)下，胞膜或胞漿某些蛋白性質(zhì)改變，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生抗這些蛋白的抗體，抗體滴度的高低更多的是免疫紊亂狀態(tài)的一種指示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示，少數(shù)乙肝活動(dòng)期患者抗黑素細(xì)胞抗體陰性的情況，可能是經(jīng)過(guò)治療，HBV復(fù)制暫時(shí)停止，細(xì)胞免疫反應(yīng)減弱的結(jié)果。

總之，經(jīng)過(guò)本研究，支持白癜風(fēng)的發(fā)生是機(jī)體免疫紊亂的結(jié)果，體內(nèi)高滴度抗黑素細(xì)胞抗體的提示機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)，發(fā)生白癜風(fēng)的可能性增加。

4結(jié)論

①乙肝組與全陰性組抗黑素細(xì)胞抗體滴度和陽(yáng)性率存在顯著性差異；②非乙肝組與全陰性組抗黑素細(xì)胞抗體滴度和陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③乙肝患者患白癜風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)增加

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編輯/申磊