亞低溫治療對(duì)心肺復(fù)蘇后大鼠腦保護(hù)作用的研究

摘要：目的 研究亞低溫治療對(duì)窒息大鼠心肺復(fù)蘇（CPR）后腦組織的保護(hù)作用。方法 建立心肺復(fù)蘇大鼠模型，將60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組）、常溫組（B組）、保存性低溫組（C組）、復(fù)蘇性低溫組（D組），除A組外，其余各組均為心肺復(fù)蘇組。心肺復(fù)蘇組組內(nèi)按心跳驟停的時(shí)間再分為3個(gè)亞組：4min組、5.5min組、7min組（n=6）。C組和D組分別在心B切開及血管穿刺操作，不進(jìn)行心肺復(fù)蘇，其余措施相同。各組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取血和腦組織標(biāo)本，分別觀察各組腦組織病理學(xué)改變及腦組織含水量。結(jié)果 與A組相比，B、C、D組腦組織含水量及病理學(xué)評(píng)分均有明顯的增加（P<0.05），與B組相比，C、D腦組織含水量有所下降，無顯著性差異（P>0.05），病理學(xué)評(píng)分有明顯的降低（P<0.05），C組腦組織含水量及量病理學(xué)評(píng)分較D組僅有數(shù)值上的降低，并無顯著差異性（P>0.05）。結(jié)論 亞低溫治療能減輕窒息大鼠心肺復(fù)蘇后腦損傷，具有腦保護(hù)效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：亞低溫；窒息心跳驟停；心肺復(fù)蘇；腦保護(hù)

心跳驟停（cardiac arrest，CA）后為全腦缺血狀態(tài)，腦損傷機(jī)制復(fù)雜不僅要渡過急性期的各種并發(fā)癥，還要面對(duì)未來長(zhǎng)期病殘所帶來的巨大物質(zhì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因而對(duì)腦缺血進(jìn)行積極有效的腦保護(hù)和腦復(fù)蘇有著非常重要的理論和實(shí)踐意義。近年腦復(fù)蘇已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，低溫是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的最有效的神經(jīng)保護(hù)方法[1，2]，較多研究亦表明亞低溫對(duì)復(fù)蘇后腦組織有保護(hù)作用[3]，但其應(yīng)用具體時(shí)機(jī)仍不明確。本文采用心臟停搏加心肺復(fù)蘇術(shù)來模擬心肺復(fù)蘇后大鼠的腦損傷，以復(fù)蘇及復(fù)蘇后30min行亞低溫治療，研究其對(duì)心肺復(fù)蘇后大鼠腦組織的保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1動(dòng)物分組 選用健康成年SD大鼠（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（渝）2011～0006）60只，雌雄不限，體重310g～350g。動(dòng)物隨機(jī)分為4組，A組：假手術(shù)組（僅進(jìn)行麻醉和氣管切開插管、血管穿刺，不進(jìn)行窒息及心肺復(fù)蘇）；B組：常溫組（動(dòng)物行常規(guī)心肺復(fù)蘇，不進(jìn)行低溫治療，以1ml/kg·min速度泵注常溫生理鹽水對(duì)照）；C組：保存性低溫組（心跳驟停時(shí)立即給予4℃生理鹽水1ml/kg·min泵注降溫，達(dá)到目標(biāo)體溫后，以0.25ml/kg·min維持體溫，其余措施同常溫組）；D組：復(fù)蘇性低溫組（ROSC后30min后給予4℃生理鹽水1ml/kg·min泵注降溫，達(dá)到目標(biāo)體溫后，以0.25ml/kg·min維持體溫，其余措施同常溫組）。B、C、D組均為心肺復(fù)蘇組，其中各組內(nèi)按心跳驟停時(shí)間（4min，5.5min，7min）的不同再分為三個(gè)亞組，各亞組均為6只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前晚上禁食，允許自由飲水，定時(shí)測(cè)量體溫，維持體溫在正常范圍，所有的手術(shù)過程均在無菌條件下進(jìn)行，以避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

1.1.2動(dòng)物模型的制備及給藥方法 參照Hendrickx等創(chuàng)建的經(jīng)典窒息法心肺復(fù)蘇模型，按照心肺復(fù)蘇Utstein-Style指南要求制作該模型，簡(jiǎn)述如下：大鼠稱重，10%水合氯醛（首劑為0.35g/100g）腹腔注射麻醉，繼以0.1g/kgoh補(bǔ)充麻醉。將動(dòng)物仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，心電監(jiān)護(hù)連續(xù)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。熱敏溫度儀探頭潤(rùn)滑后插入肛門約3～4cm.進(jìn)行持續(xù)深部肛溫監(jiān)測(cè)以替代腦溫測(cè)定。小兒頭皮針開放尾靜脈通道，供復(fù)蘇給藥和補(bǔ)液用。常規(guī)備皮、消毒，行頸部正中切口，分離切開氣管并插管。切開左側(cè)腹股溝中部皮膚，分離股動(dòng)脈，置入24G套管針，連接生物信號(hào)采集系統(tǒng)，顯示動(dòng)脈波形，監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓（MAP），用稀釋的肝素鈉（上海第一生化藥業(yè)有限公司）鹽水間斷性沖管，并將套管針縫合固定在皮膚上。大鼠術(shù)后室溫下穩(wěn)定10 min，靜脈注射短效肌松劑琥珀膽堿（旭東海普制藥有限公司）2mg/kg，同時(shí)夾閉氣管致CA。如達(dá)到CA標(biāo)準(zhǔn)，按分組要求進(jìn)行4℃鹽水降溫或常溫鹽水對(duì)照處理，CA持續(xù)4min，5.5min或7min后，立即實(shí)施心肺復(fù)蘇。胸外按壓頻率160次/min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑的1/3，接ALC-V9動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾特生物科技有限公司）純氧機(jī)械通氣，呼吸頻率80次/min，潮氣量6ml/kg，按壓10～15s后予腎上腺素（福州海王福藥制藥有限公司）0.02mg/kg，5%碳酸氫鈉（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）1 mg/kg，2min內(nèi)效果不明顯者可重復(fù)給藥，直到自主循環(huán)恢復(fù)（ROSC）。15min無效者放棄復(fù)蘇。ROSC后連續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓，心率（HR），心電。ROSC 4h后撤離呼吸機(jī)，處死動(dòng)物。

1.2標(biāo)本的采集 各組大鼠于心跳驟停時(shí)、ROSC后4h經(jīng)股動(dòng)脈取血3ml，標(biāo)本即時(shí)離心（3000rmp，lOmin），取上清液于Eppendorf管，放入-70℃冰箱保存待測(cè)。留取血標(biāo)本后，將大鼠置于冰墊上，加深麻醉，開胸暴露心臟，直視下將穿刺針頭經(jīng)左心室插入主動(dòng)脈并固定，剪開右心耳，經(jīng)心臟快速灌注生理鹽水，一般為動(dòng)物體重的2倍，直至右心房流出液變清，然后以4%多聚甲醛100ml灌注，先快后慢，在充分灌流后取腦，置于4%多聚甲醛中固定。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1腦組織含水量（BWC）的測(cè)定 標(biāo)本的采集方法同上，取左半腦，用電子天平稱量濕重，電熱恒溫干燥箱內(nèi)烘烤24h，稱取干重，計(jì)算腦組織含水量：按Elliott方法（干濕比重法）計(jì)算腦組織百分水含量：腦水含量=（濕量一干量）/濕量×100%。

1.3.2組織病理切片觀察 采用專人盲法在400倍顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，參照孔雷[4]等所敘的腦組織病理評(píng)分方法并加以改良，對(duì)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管分別作組織學(xué)評(píng)分。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)均以x±s表示。同組內(nèi)均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組之間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene's法，若方差不齊，則采用秩和檢驗(yàn)。多組之間均數(shù)多重比較采用SNK法。雙變量關(guān)聯(lián)性分析采用person's積矩相關(guān)分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠腦組織含水量測(cè)定 與假手術(shù)組（A組）相比，B、C、D組腦組織含水量均有明顯的增加（P<0.05），與B組相比，C、D組腦組織水含量在數(shù)值上有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。C組腦組織含水量較D組僅有數(shù)值上的降低，也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性（P>0.05）（見表1）。

2.2各組大鼠大腦皮層組織HE染色 A組（圖1）腦組織形態(tài)學(xué)變化不明顯，神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞大小正常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，但有時(shí)可見部分神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞輕度水腫；B組（圖2）鏡下可見神經(jīng)元胞核固縮呈菱形、三角形，核深染，細(xì)胞腫脹，結(jié)構(gòu)不清，空隙明顯增大并與周圍組織分界清楚。膠質(zhì)細(xì)胞增生，水腫周圍間隙擴(kuò)大，空泡樣改變，可見嗜神經(jīng)現(xiàn)象。血管周圍間隙增寬，可見點(diǎn)狀片狀出血。C、D組（圖3、4）大腦皮層組織病理變化隨缺血時(shí)間和開始誘導(dǎo)亞低溫時(shí)間的不同，受損程度也不一致，輕者神經(jīng)元細(xì)胞僅見輕度水腫，胞核清晰，血管間隙輕度增大，膠質(zhì)細(xì)胞輕度水腫并增生，損傷不明顯；較重者神經(jīng)元細(xì)胞明顯腫脹，與周圍結(jié)構(gòu)分界清楚，形態(tài)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，有時(shí)可見血管內(nèi)點(diǎn)狀出血。膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，部分水腫較重，呈空泡樣改變。

2.3各組大鼠腦組織病理學(xué)評(píng)分 與A組比較，B、C、D組腦組織病理學(xué)評(píng)分較A組明顯增高（P<0.05），C、D組與B組相比，腦組織病理學(xué)評(píng)分明顯下降（P<0.05）（見表2）。

3討論

CA的本質(zhì)是機(jī)體器官缺血再灌注損傷的過程，對(duì)腦組織而言，影響尤其嚴(yán)重。腦組織幾乎無氧儲(chǔ)備，能量?jī)?chǔ)備也很少。許多研究證實(shí)[5]：腦血供停止10s可出現(xiàn)意識(shí)不清；2～4min后大腦儲(chǔ)備的葡萄糖和糖原將耗盡；4～5min后ATP耗盡。心跳停止后4～6min可產(chǎn)生不可逆性腦損害或腦死亡。CPR后腦組織經(jīng)歷了從無血流到低血流到再灌注的過程，腦再灌注損傷是CPR成功后的必然結(jié)果，也是腦復(fù)蘇必須解決的關(guān)鍵問題。但即使進(jìn)行了有效的復(fù)蘇，隨之而產(chǎn)生的體溫升高，復(fù)氧傷害，血液成分的改變等病理機(jī)制可使神經(jīng)系統(tǒng)功能惡化。尤其是體溫，每升高1℃，腦代謝率大約增加8%，加重腦缺氧，形成惡性循環(huán)，繼而發(fā)生多器官功能障礙綜合征（Multiple organ dysfunction syndrome MODS）是復(fù)蘇后死亡率居高不下的原因之一。

亞低溫對(duì)腦損害的保護(hù)作用自二十世紀(jì)八十年代以來已越來越為國(guó)內(nèi)外學(xué)者所重視，研究也愈發(fā)深入。1987年Busto等[6]首先報(bào)道了不同的亞低溫條件下大鼠全腦缺血后腦組織的保護(hù)作用的差異，研究發(fā)現(xiàn)，34℃亞低溫下動(dòng)物腦缺血1h后其紋狀體背外側(cè)神經(jīng)元和海馬錐體細(xì)胞僅有20%神經(jīng)元發(fā)生異常，而30℃～33℃亞低溫動(dòng)物則未見任何病理學(xué)損害，而正常腦溫動(dòng)物則是100%病變。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腦溫下降（2～3）℃（亞低溫）對(duì)腦損傷也有保護(hù)作用，且副作用輕微，使低溫治療重新引起人們的興趣[7]。大量研究已經(jīng)證實(shí)：亞低溫治療可減輕心肺復(fù)蘇后腦缺血再灌注損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，并在國(guó)內(nèi)外眾多臨床試驗(yàn)中取得了明顯的療效。不僅在缺血中，而且在缺血后開始亞低溫治療均可以明顯減輕腦缺血后腦組織病理形態(tài)學(xué)損害程度，促進(jìn)腦組織神經(jīng)功能的恢復(fù)，有明顯的腦保護(hù)作用。亞低溫治療對(duì)腦缺血、腦損傷的保護(hù)作用機(jī)制是多方面的，目前已證實(shí)的主要有兩大方面：一是從功能方面上講，亞低溫可有效降低腦的代謝水平從而降低腦耗氧量，延緩各種有害代謝產(chǎn)物的堆積[8]。另一方面，從結(jié)構(gòu)上看，亞低溫可以保護(hù)血腦屏障緩解腦水腫從而降低顱內(nèi)壓，對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用，同時(shí)還可減輕腦白質(zhì)損傷和抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖[9，10]。

本實(shí)驗(yàn)通過窒息方法建立大鼠心跳驟停模型，心肺復(fù)蘇至大鼠ROSC，分別予心跳驟停時(shí)及ROSC后30min給予4℃生理鹽水，研究發(fā)現(xiàn)，心肺復(fù)蘇各組腦組織含水量均較假手術(shù)組明顯增高，低溫組較常溫組有所下降，但無明顯差異性。心肺復(fù)蘇后，大鼠腦組織可出現(xiàn)神經(jīng)元水腫，細(xì)胞腫脹，結(jié)構(gòu)不清，核固縮，膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，部分水腫較重，呈空泡樣改變，有時(shí)可見血管內(nèi)點(diǎn)狀出血等改變，腦組織病理學(xué)評(píng)分較假手術(shù)組明顯增高，但經(jīng)亞低溫治療后，腦組織病理學(xué)評(píng)分較常溫組明顯下降，其中，保存性低溫組較復(fù)蘇性低溫組更低，但兩組無明顯差異。目前保存性低溫組大鼠恢復(fù)亞低溫治療已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可，但要取得好的治療效果，應(yīng)在缺血損傷后盡早進(jìn)行，另一方面，CPR后缺血損傷過程持續(xù)數(shù)天，因此將低溫持續(xù)的時(shí)間延長(zhǎng)可能會(huì)有收益[11]。本研究亦證實(shí)，早期進(jìn)行亞低溫治療，對(duì)心肺復(fù)蘇后腦組織有保護(hù)作用，但在心臟停跳期間給予低溫療法還是在成功心肺復(fù)蘇后給予低溫療法，以及亞低溫治療的時(shí)間目前尚無定論，此外，亞低溫腦保護(hù)作用機(jī)制亦需要深入研究和探討。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hemmen TM，Lyden PD.Induced hypothermia for acute stroke[J].Stroke，2007，38（2）：794-799.

[2]Lyden PD，Krieger D，Yenari M，et al.Therapeutic hypothermia for acute stroke[J].Int J Stroke，2006，1（1）：9-19.

[3]李燕玲，李培杰.亞低溫治療對(duì)復(fù)蘇后腦保護(hù)作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)急救醫(yī)學(xué).2010，30（7）：647-650.

[4]孔雷，韓天權(quán)，于穎彥，等.胰酶、細(xì)胞因子、高滲液和感染對(duì)大鼠腦損傷的形態(tài)學(xué)研究[J].胰腺病學(xué).2004，4（2）：98-101.

[5]梁璐，于學(xué)忠.腦復(fù)蘇的臨床研究進(jìn)展[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2006，9（20）：1664-1667.

[6]BustoR，Dietrich WD，Globus MYT.Small differences intraischemicbrain temperature critically determine the extent of ischemic neuronalinjury[J].J Cereb Blood Flow Metab，1987，7：729-735.

[7]Nanda S，Patel NC，Bhatt SP，et al.Therapeutic medical hypothermia-a multispecialty approach[J].Recent Pat Cardiovasc DrugDiscov，2010，5（3）：212-222.

[8]Erecinska M，Thoresen M，Silver IA.Effects of hypothermia on energy metabolism in Mammalian central nervous system.J Cereb Blood Flow Metab，2003，23：513-530.

[9]Roelfsema V，Bennet L，George S，et al.Window of opportunity of cerebral hypothermia for postischemic white matter injury in the nearterm fetal sheep[J].J Cererb Blood Flow Metab.2004，24：877-886.

[10]Hachimi-Idrissi S，Van Hemelrijck A，Michotte A，et al.Postischemic mild hypothermia reduces neurotransmitter release and astroglial cell proliferation during reperfusion after asphyxial cardiac arrest in rats[J].Brain Res，2004，1019：217-225.

[11]Dixon SR，Whitbourn RJ，Dae MW，et al.Induction of mild systemic hypothermia with endovascular cooling during primary percutaneous coronary intervention for acute myocardial infarction[J].J Am Coll Cardiol 2002.40：1928-1934.編輯/申磊