豚鼠自身免疫性梅尼埃病相關抗原相對分子質量58000蛋白的二維電泳和質譜分析

摘要：目的 探尋導致豚鼠自身免疫性梅尼埃?。╝utoimmune Meniere's disease，AIMD）模型的內耳組織抗原成分中相對分子質量為58 000的蛋白質成分。方法 雙向凝膠電泳方法分離豚鼠內耳組織抗原成分，用ImageMaster圖像分析軟件選擇相對分子質量為58 000的蛋白質點，對這些蛋白質點進行質譜分析，通過Mascot軟件查詢Swiss-prot數據庫，利用PathwayStudio軟件對查詢到的蛋白進行生物信息學分析，獲得引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白。結果 獲得重復性和分辨率都較好的雙向電泳圖譜，軟件分析相對分子質量58 000蛋白共獲得20個蛋白質點；質譜分析后查詢數據庫鑒定得到11個蛋白質。這些蛋白分別與免疫、凋亡和分化等功能相關，其中凝血因子C從相對分子質量、Mascot評分和蛋白功能等方面綜合評估結果提示其可能作為相對分子質量58000蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白抗原。結論 成功獲得豚鼠自身免疫性梅尼埃病模型主要內耳抗原成分中相對分子質量58 000蛋白的雙向凝膠電泳圖譜，并應用質譜技術鑒定蛋白質點。綜合分析提示凝血因子C可能為相對分子質量58 000蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白。

關鍵詞：梅尼埃??；自身免疫；內耳抗原

自身免疫性內耳疾?。╝utoimmune inner ear disease，AIED）是臨床上極少數治療效果較好一類內耳疾病，自身免疫性梅尼埃病（autoimmune Meniere's disease，AIMD）屬于自身免疫性內耳疾病（autoimmune inner ear disease，AIED）的一種。本項目組前期實驗研究結果顯示，相對分子質量為58 000的內耳組織抗原為導致豚鼠AIMD的主要抗原成分之一[1，2]。本研究擬對豚鼠內耳組織中相對分子量58 000的抗原采用蛋白質組學的技術，進行分離鑒定，為AIMD在特異性抗原方面的進一步研究打下基礎。

1資料與方法

1.1實驗動物 健康、白色、紅目豚鼠3只，3月齡，雌雄不限，體重250～300g，由南京市江寧青龍山動物繁殖場提供，豚鼠耳廓反射正常，耳鏡檢查排除中耳疾患。

1.2試劑與儀器

1.2.1蛋白質提取、雙向電泳 固相pH梯度膠條（24cm，pH3～10NL）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、APS、Tris、超純尿素、DTT、硫脲、CHAPS、載體兩性電解質（Pharmalytes pH3～10）、膠槽清洗液、凝膠覆蓋液、碘乙酰胺、低熔點瓊脂糖、溴酚蘭；BCA試劑盒；十二烷基磺酸鈉；蛋白酶抑制劑cocktail、37%甲醛；分子量標準蛋白質（130、95、72、55、43、34、26kD）；甘油、無水乙醇、冰醋酸、無水乙酸鈉、碳酸鈉、硫代硫酸鈉、硝酸銀、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA.Na2）、磷酸、蔗糖、濃鹽酸均為國產分析純；所有溶液均用去離子水配制。

1.2.2質譜分析 乙晴，碳酸氫胺，三氟乙酸，序列修飾后胰蛋白酶。MALDI-MS質譜儀BIFLEXⅣ。

1.2.3免疫印跡法試驗 PVDF膜（Millipore Corporation）；化學發(fā)光試劑盒（Cell Signaling Technology，Inc）。CS-15R臺式高速冷凍離心機；Bio-Rad ModeL 680垂直電泳槽、電轉移槽；

1.3方法

1.3.1抗原制備 制備豚鼠內耳組織抗原[3]，方法：清醒狀態(tài)下斷頭，取聽泡，分離膜迷路（主要包括螺旋韌帶、基底膜、膜半規(guī)管、橢圓囊和球囊），置于150μl裂解液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，40mmol/L Tris，65mmol/L DTT，2%IPG緩沖液，1%Cocktail，去離子水），經剪切、超聲粉碎及均漿，12000 r/min 4℃離心5min，取上清貯于-80℃?zhèn)溆?。用BCA法測蛋白質濃度。

1.3.2雙向凝膠電泳 第一相固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等電聚焦主要參照G？紫rg等[4]的方法進行，簡述：采用pH3～10NL，24cm干膠條，每份以120μg內耳抗原總蛋白質與水化液（8mol/L尿素、20mmol/LDTT、2%CHAPS、0.5%IPG緩沖液以及0.001%溴酚蘭）充分混合，總體積450μl。用IPGphor等電聚焦儀，進行第一向等電聚焦，在20℃下自動運行。

1.3.3凝膠染色和掃描及圖像分析 雙向電泳后的2-DE膠，為了制備蛋白用于質譜分析而采用硝酸銀染色。染色后的雙向電泳凝膠用ImageScannerTM掃描儀進行透射掃描，數字化圖象文件運用Amersham Pharmacia公司的ImageMasterR 2D Elite（Version 2.00）軟件分析。比較3次重復結果圖譜，獲得標準圖譜。選擇相對分子質量為58 000的20個蛋白質點進行下一步實驗。

1.3.4質譜分析及數據庫查詢 選取2-DE凝膠上相對分子質量為58 000的20個蛋白質點在圖像上做好標記，編號為1～20。20個蛋白質點在經過切膠、脫色、干膠后進行酶切、點樣。得到的肽質量指紋圖譜利用Mascot搜索引擎（http：//www.matrixscience.com//mascot/cgi/search_form.pl？FORMVER=2SEARCH=PMF）進行數據庫檢索，其中蛋白質數據庫選擇SwissProt庫。結合雙向電泳圖譜上相應點的等電點、分子量綜合分析。

2結果

2.1二維電泳及凝膠分析結果：電泳后的凝膠圖譜呈現良好的重復性和穩(wěn)定性，經圖像軟件分析相對分子質量為58 000的共有20個蛋白質點（圖1）。將這20個蛋白質點從1～20依次編號，并對其進行質譜分析。

圖1 豚鼠內耳組織抗原雙向凝膠電泳圖譜

1～20分別為相對分子質量為58kD的20個蛋白質點。

2.2質譜結果及生物信息學分析 將這20個蛋白點進行MALDI-TOF-MS分析，以基質峰和酶自動降解峰進行校正，獲得各蛋白點的肽片斷質量指紋圖譜。用Mascot搜索引擎在SwissProt數據庫進行查詢，結合雙向電泳圖譜上相應點的表觀等電點、分子量綜合分析，前17個蛋白質點被成功鑒定，部分蛋白質點得到同一種蛋白，總共獲得11個蛋白（圖2）。第一個蛋白點得到兩個蛋白，其余各點都為一個蛋白；1、7、9、10、15和17六個點都得到凝血因子C，從相對分子質量、Mascot評分和蛋白功能等方面綜合評估，凝血因子C可能為58kD蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白。

圖2 質譜分析后在SwissProt數據庫搜索到的蛋白質

蛋白質點1～17經分析得到結果，第一個蛋白點為混合點，分別得到兩個蛋白，其余各點為一個蛋白。

3討論

內耳自身免疫性病理損傷在感音神經性聾（sensorineural hearing loss，SNHL）、梅尼埃?。∕eniere's disease，MD）等內耳疾病的發(fā)生及其病理機制中可能起著重要作用[5，6]。實驗研究證實多種內耳抗原在AIED的發(fā)病中起重要作用，對這些內耳抗原的研究將有助于找到敏感而特異的血清學檢測方法，作為臨床診斷的重要依據。

之前的研究初步篩選出分子量為68KD、58KD、42KD、28KD的蛋白質可能是致內耳自身免疫病理損傷的主要抗原成分[1]，發(fā)現68kD蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白為波形蛋白[7]。本研究擬對豚鼠內耳組織中相對分子量58KD的抗原采用蛋白質組學的技術，進行分離鑒定，為AIMD在特異性抗原方面的進一步研究打下基礎。我們用雙向凝膠電泳方法分離豚鼠內耳組織抗原成分，用ImageMaster圖像分析軟件選擇獲得20個相對分子質量為58kD的蛋白質點，對這些蛋白質點進行質譜分析，通過Mascot軟件查詢Swiss-prot數據庫，最后得到11個蛋白，其中六個點都得到凝血因子C。

58kD蛋白在自身免疫性內耳疾病的研究中非常重要，而其成分究竟為何仍存在爭議，Boulassel[8]等發(fā)現多種內耳疾病患者血清可以與58kD內耳蛋白反應進而通過實驗推斷58kD蛋白是COCH5B2蛋白。凝血因子C同源物（coagulation factor C homology，COCH）基因是人類發(fā)現的第一個伴前庭功能障礙的常染色體顯性遺傳非綜合征性耳聾基因，在耳蝸和前庭組織中有高度表達，COCH基因突變可致患者出現漸進性感音神經性耳聾、前庭功能障礙癥狀[9]。

過去研究表明自身免疫因素是內耳疾病的病因之一，但這些免疫介導的聽力損失尚缺乏明確的診斷標準，主要依賴聽力學損害、免疫試驗陽性及應用激素治療有效來判斷。我們項目組將對這些內耳抗原繼續(xù)研究，進而找到敏感而特異的血清學檢測方法。

參考文獻：

[1]陸玲，譚長強，崔毓貴，等.豚鼠自身免疫性梅尼埃病模型的主要內耳抗原分析[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2008，43（8）：596-600.

[2]李玉瑾，譚長強，黃和，等.純化內耳組織抗原免疫致豚鼠自身免疫性梅尼埃病的實驗研究[J].東南大學學報（醫(yī)學版），2009，28（3）：157-162.

[3]譚長強，董偉達，陸玲.同種內耳抗原免疫孕豚鼠所產子鼠聽覺損傷程度與母鼠特異性免疫反應水平相關性研究[J].東南大學學報（醫(yī)學版），2007，26：397-402.

[4]G？rg A，Obermaier C，Boguth G，et al.The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients[J]. Electrophoresis，2000，21（6）：1037-1053

[5]Quinton Gopen，Elizabeth M.Keithley，et al.Mechanisms underlying autoimmune inner ear disease[J]. Drug Discovery Today：Disease Mechanisms，2006，3：137-142

[6]肖紅俊，龔樹生，汪吉寶.三種原因不明內耳病抗內耳組織自身抗體的檢測[J].中華耳鼻咽喉科雜志，1995，30：17-19.

[7]李王偉，董偉達，譚長強等豚鼠自身免疫性梅尼埃病相關抗原相對分子質量68 000蛋白的二維電泳和質譜分析[J].東南大學學報（醫(yī)學版），2011，30（3）：417-422.

[8]Boulassel MR，Tomasi JP，Deggouj N，et al.COCH5B2 is a target antigen of anti-inner ear antibodies in autoimmune inner ear diseases[J]. 6Otol Neurotol，2001，22（5）：614-618

[9]孫勍，于飛，劉新.等.自身免疫性感音神經性聾患者候選基因--凝血因子C同源物突變篩查[J].chinese journal of otology，2008，6（3）：302-305.

編輯/申磊