應(yīng)用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)的腦片制備體會(huì)

摘要：目的 探討應(yīng)用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)的腦片制備的技術(shù)和方法。方法 新鮮腦組織取材，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，取相應(yīng)腦區(qū)組織，振動(dòng)切片機(jī)切片。然后放入孵育槽內(nèi)孵育備用。后在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果 切片完整，厚薄均勻，腦組織切片細(xì)胞活性較高。符合膜片鉗實(shí)驗(yàn)需求。結(jié)論 符合實(shí)驗(yàn)需求的腦片，從溫度控制、取材、切片等環(huán)節(jié)都要仔細(xì)。

關(guān)鍵詞：腦片；膜片鉗；電生理

中圖分類號(hào)：R338.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

電生理實(shí)驗(yàn)技術(shù)是生理學(xué)研究中非常重要的實(shí)驗(yàn)手段和技術(shù)之一，其中腦片電生理實(shí)驗(yàn)具有其突出的優(yōu)點(diǎn)，可以比較直觀、快速地觀察到腦細(xì)胞的放電情況以及藥物對它的影響，同時(shí)又可以排除在體的復(fù)雜因素對其的影響，可以進(jìn)行長時(shí)間的高質(zhì)量的記錄。腦片已被廣泛用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種疾病的研究[1]。腦片制備的影響因素很多，為了獲得活性良好的腦片標(biāo)本，本文總結(jié)了腦片制備過程中的經(jīng)驗(yàn)， 為從事相關(guān)工作的人員提供一些參考和借鑒?，F(xiàn)報(bào)道如下[2]。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生1～2d的Wistar乳大鼠，由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid， ACSF）成分及濃度為（mM）：NaCl（氯化鈉）126，KCL（氯化鉀）5，NaHCO3（碳酸氫鈉）26，CaCl2（氯化鈣）2，MgCl2（氯化鎂） 2， NaH2PO4（磷酸二氫鈉）1.25，Glucose（葡萄糖）10。用氫氧化鈉或者稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4。瞬間粘合劑（502膠）；振動(dòng)切片機(jī)（MA752Motorised Advance Viborslice UK）； 腦片孵育槽；恒溫水浴鍋。

1.2方法 首先將瓊脂塊，切割成適宜大小，在振動(dòng)切片機(jī)標(biāo)本臺(tái)上涂上少量粘合劑，然后將修整好的瓊脂塊粘貼在標(biāo)本臺(tái)上。制備1000mlACSF，置于冰箱里，溫度設(shè)置為4℃，然后取500ml燒杯，加入250mlACSF，并通入飽和的混合氣體（95%O2+5%CO2），放于恒溫水浴鍋，將水溫設(shè)置為36℃。待準(zhǔn)備就緒后，開始麻醉動(dòng)物。

選擇出生1～2d的Wistar乳大鼠，用1%戊巴比妥鈉（0.5ml/100g）麻醉，迅速斷頭，小心取出腦組織，剝離腦組織時(shí)動(dòng)作要輕柔準(zhǔn)確，切忌擠壓腦組織而影響細(xì)胞活性，將剝離好的大腦修塊，置于持續(xù)灌流有飽和混合氣（95%O2+5%CO2）的4℃ACSF中，然后取出大腦，平整放于事先置于冰面的倒扣的培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)皿上可以放置一張ACSF浸潤過的濾紙，用濾紙稍吸干腦組織表面的ACSF，在標(biāo)本臺(tái)上涂少量粘合劑，然后將腦組織粘貼在標(biāo)本臺(tái)上，振動(dòng)切片機(jī)槽內(nèi)充以0℃ACSF冰水混合物，以保持低溫環(huán)境，降低腦組織的代謝率，而且使腦組織具有一定硬度，利于切片，并且持續(xù)灌流有飽和混合氣（95%O2 +5%CO2）。應(yīng)用振動(dòng)切片機(jī)切片，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，振動(dòng)幅度調(diào)整為 0.75mm，推進(jìn)速度為0.18mm/s，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，依據(jù)圖譜，選擇切片位置，使刀片與相關(guān)腦區(qū)解剖位置接近，切取腦片，切片厚度可以選擇300μm～400μm之間。應(yīng)用廣口吸管將切好的腦片轉(zhuǎn)移到恒溫（36℃）恒速灌流（約3～4ml/min）ACSF的自制的浸入式孵育槽或燒杯中，孵育1h后待用[3]。我們在實(shí)驗(yàn)中的體會(huì)是，應(yīng)用切片機(jī)切片時(shí)標(biāo)本移動(dòng)的慢一些，切片機(jī)振幅大一些，腦片活性較好。上述操作應(yīng)控制在30min內(nèi)結(jié)束。

2 結(jié)果

腦片活性判斷方法：肉眼觀察腦片顏色，活性良好的腦片呈淡黃色或粉紅色，具有一定的韌性，轉(zhuǎn)移到記錄槽后可以自行舒展開；若腦組織顏色發(fā)白，韌性差，轉(zhuǎn)移到記錄槽后不容易自行舒展開，則說明活性已經(jīng)喪失[4]。此外，鏡下觀察：腦片上表面是否出現(xiàn)了干燥現(xiàn)象。如果出現(xiàn)纖維狀條紋，表明腦片表面絕大部分細(xì)胞已經(jīng)窒息死亡[2]。健康的神經(jīng)元表面光滑、輪廓清晰、有立體感，突觸結(jié)構(gòu)清楚，當(dāng)電極尖端壓迫細(xì)胞膜時(shí)可以形成凹陷；若胞漿中有顆粒或可見細(xì)胞核，則表明神經(jīng)元已經(jīng)受損；死亡的神經(jīng)元立體感消失， 細(xì)胞皺縮或腫脹呈空泡狀， 如腦片中活性良好神經(jīng)元少見或見大片神經(jīng)元死亡說明腦片活性差[4]。

3 討論

制備活性良好的腦片是膜片鉗電生理實(shí)驗(yàn)成功的重要前提之一。本實(shí)驗(yàn)室通過大量腦片制備的摸索實(shí)踐，總結(jié)出如下注意事項(xiàng)：一般選擇出生1～2d的乳鼠。原因在于，幼年動(dòng)物顱骨較成年動(dòng)物軟，易于將腦組織順利取出；幼年動(dòng)物腦細(xì)胞膜韌性好，易于形成高阻封接。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的時(shí)間控制，如，取腦動(dòng)作要迅速、輕柔，時(shí)間一般控制在3min內(nèi)較好[5]。溫度控制，ACSF應(yīng)事先冷凍以降低腦組織氧耗，而且有助于提高腦組織硬度，在0℃冰水混合物中腦組織硬度較好，尤其利于切薄片。給氧： 腦組織接觸的全部液體均應(yīng)為飽和氧混合氣體（95%O2、5%CO2）， 以保持恒定的pH值和氧飽和度， 但給氧時(shí)氣流不應(yīng)過大，否則氣泡直接沖擊腦片，會(huì)迅速引起大量細(xì)胞死亡，需要重新制備腦片[4]。

總之，活性良好的腦片制備有一定的技巧和經(jīng)驗(yàn)，為了更好地完成腦片膜片鉗實(shí)驗(yàn)，應(yīng)多總結(jié)經(jīng)驗(yàn)和技巧，保證

腦片的質(zhì)量和活性。

參考文獻(xiàn)：

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[3]蘇彥欣，苗慶峰，張偉，等. 大麻素anandamide對大鼠海馬腦片LTP和海馬細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國老年學(xué)雜志，2006，26（5）：668-671.

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[5]劉志洋，王會(huì)芳，何海斌，等. 探索應(yīng)用于膜片鉗研究的腦片制備方法[J]. 吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34（5） ：326-328.編輯/哈濤