液相芯片技術(shù)在國內(nèi)的發(fā)展現(xiàn)狀

從20世紀(jì)90年代開始生物芯片已在全球進行應(yīng)用，其最初用于基因序列分析、基因表達譜和基因突變體的檢測等，主要用于基因分析，故又稱為基因芯片或DNA芯片。而隨著其被廣泛應(yīng)用于免疫反應(yīng)、受體結(jié)合等領(lǐng)域，出現(xiàn)了蛋白芯片、細胞芯片和組織芯片等[1-2]各種生物芯片。

液相芯片是在20世紀(jì)90代中期發(fā)展起來的，又被稱為xMAP技術(shù)，集流式細胞技術(shù)、激光、數(shù)字信號處理系統(tǒng)和傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體的，具有新型通量大、靈活性好，靈敏度高、動力學(xué)范圍廣等優(yōu)點[3-4]。

1原理

1.1 Luminex液相芯片的技術(shù)原理 Luminex液相芯片技術(shù)是基于多種標(biāo)記有不同熒光染料的聚苯乙烯微球，微球直徑一般為5.6 um，微球主要有4種：MicroPlex微球，SeroMap微球、xTAG微球和MagPlex微球。（4種微球原理基本相同，而SeroMap微球是專門為血清學(xué)設(shè)計的，它可以減少血清中不同抗體與微球的非特異性結(jié)合。在臨床診斷中主要應(yīng)用Luminex液相芯片技術(shù)用于檢測腫瘤指標(biāo)、細胞因子及其它一些蛋白質(zhì)物質(zhì)，因此主要是應(yīng)用SeroMap微球進行檢測。）在液相系統(tǒng)中，為了區(qū)分不同的探針，每一種固定有探針的微球都有一個獨特的色彩編號，或稱熒光編碼。不同的顏色微球在激光作用下發(fā)出的熒光均不相同，利用這些微球可以分別標(biāo)記上不同的探針分子。檢測時先后加樣品和報告分子與標(biāo)記微球反應(yīng)，樣品中的目的分子（待檢測的抗原或抗體）能夠與探針和報告分子特異性結(jié)合，使交聯(lián)探針的微球攜帶上報告分子藻紅蛋白，隨后儀器對微球進行檢測和結(jié)果分析。Luminex檢測系統(tǒng)采用微流技術(shù)使微球快速單列通過檢測通道，并使用紅色和綠色兩種激光分別對單個微球上的分類熒光和報告分子上的報告熒光進行檢測。紅色激光可將微球分類，從而鑒定各個不同的反應(yīng)類型（即定性）；綠色激光可確定微球上結(jié)合的報告分子的數(shù)量，從而確定微球結(jié)合的目的分子的數(shù)量（定量）。

1.2液相芯片的技術(shù)優(yōu)勢

1.2.1高通量、高速度、操作方便 分析熒光速度最高可達5000～15000個/s；可對同一樣本中的多種不同目的分子同時進行實時、定性、定量分析，時間不到3 h。其孵育時間比傳統(tǒng)的固相檢測明顯縮短，而ELISA每孔僅只能對一種指標(biāo)進行檢測，雖有自動酶儀，一次也最多只能檢測幾塊板。采用液相芯片法可以提高檢測速度。同時針對Luminex系統(tǒng)，國內(nèi)廠家已生產(chǎn)了配套的自動加樣儀系統(tǒng)，基本上已實現(xiàn)全自動化檢測。

1.2.2高靈敏度 液相芯片的微球表面積大于固相表面，固定的包被抗體可達100000個。提高了檢測的靈敏度，檢測范圍或達3～5個數(shù)量級，最低檢測濃度可達0.1 pg/mL。

1.2.3特異性強、準(zhǔn)確性好 因為是采用均相免疫檢測，與異相免疫相比實驗無需進行洗滌，減少了在操作過程中因洗滌帶的的實驗結(jié)果誤差。在檢測時采用了流式激光技術(shù)，在測定時是對每個微球進行檢測，防止標(biāo)本中的異抗原（抗體）的干擾。

1.2.4標(biāo)本用量小 由于在同一個反應(yīng)孔中同時檢測多種指標(biāo)，與其它方法相比明顯減少了標(biāo)本用量，非常適合稀有標(biāo)本與兒童樣本的檢測。

2液相芯片技術(shù)的應(yīng)用進展

液相芯片技術(shù)是迄今為止被美國食品藥品管理局（FDA）惟一批準(zhǔn)用于臨床診斷的生物芯片技術(shù)。到2005年全球獲得FDA認(rèn)證的液相芯片項目已近200個。其全球最達的檢測平臺為美國Luminex公司和荷蘭的QIAGEN跨國公司。而在美國Luminex公司生產(chǎn)的Luminex檢測系統(tǒng)上，目前已有國內(nèi)生產(chǎn)的商品化試劑供應(yīng)：比如上海透景公司生產(chǎn)的腫瘤標(biāo)志物檢測產(chǎn)品、HPV檢測產(chǎn)品。另外多種研究者根據(jù)研究需要自行制備探針微球交聯(lián)微球，建立反應(yīng)體系對各種標(biāo)本進行檢測。目前液相芯片技術(shù)應(yīng)用主要是用于抗原--抗體反應(yīng)的液相蛋白芯片和用于核酸雜交的液相基因芯片。在國內(nèi)的應(yīng)用主要涉及以下幾個領(lǐng)域。

2.1在細胞因子檢測方面的應(yīng)用 細胞因子是T細胞產(chǎn)生的一大類能在細胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽。因此同時檢測多種細胞因子可以全面判斷機體免疫功能，在疾病的診斷、病程觀察及療效評價方面有重要意義，還能用于研究發(fā)病機制與藥物作用的機理。

目前臨床上常用ELISA法檢測細胞因子，這種方法存在一些局限性：一個試劑盒僅能檢測一種因子、檢測的線性窄，高濃度標(biāo)本需稀釋后才能進行檢測。同時標(biāo)本用量較大，不利于臨床開展，常用于實驗研究。

吳容等采用液相芯片法檢測了過敏性紫癜患兒血漿中的IL-2、IFN-r、IL-4水平。在HSP患兒急性期 Th1類細胞因子IL-2、IFN-r水平降低，Th2類細胞因子 IL-4水平增高。陳士嶺等采用Luminex液相蛋白芯片檢測著床窗期子宮內(nèi)膜和早孕蛻膜基質(zhì)細胞的細胞因子水平，用Luminex液相蛋白芯片技術(shù)檢測了從著床窗期子宮內(nèi)膜到早孕蛻膜表達15種細胞因子的變化，發(fā)現(xiàn)其間存在著正相關(guān)、負(fù)相關(guān)或不相關(guān)的關(guān)系。為研究胚胎著床和妊娠建立過程中細胞因子網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性提供了依據(jù)，提示它們之間可能存在的相互協(xié)同依賴或相互拮抗的關(guān)系。鄧元江[5]等采用液相芯片檢測了慢性充血性心力衰竭患者血清中細胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β及IL-10的水平，在CHF組中血清TNF-α，IL-6的含量均高于正常對照組（P<0.05或P<0.01），而IL-10的含量無明顯變化。王成[6]，駱玉霜[7]等分別采用液相芯片檢測了青年女性胃癌組織和晚期胃癌患者的ERCC 1、TYMS、TUBB3 mRNA的水平。ERCC1 mRNA低表達患者使用鉑類藥物效果明顯優(yōu)于ERCC1高表達者。TUBB3 編碼的β-Tubulin-Ⅲ（3型β微管蛋白）與抗微管化療藥敏感性的關(guān)系最密切。低TUBB3表達水平的腫瘤患者接受紫杉醇類化療的效果較好，中位生存期較長。反之，TUBB3高表達的患者的抗微管類化療藥物療效較差。TYMS（thymidylate synthetase）基因編碼的胸苷酸合成酶（TS）是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是腫瘤生長的重要因子。低TYMS mRNA水平的腫瘤患者接受氟類化療的效果較好，中位生存期較長。李凱軍[8]、鄭璐玉[9]和王爽[10]等分別檢測了淚液、痰濕體質(zhì)人群和重癥手足口病患兒血清中的細胞因子。顯示細胞因子與各種疾病有密切關(guān)系。中山大學(xué)的王敏儀碩士采用液相芯片技術(shù)檢測超排卵患者卵泡液中細胞因子水平。由于細胞因子檢測往往需要幾種因子一起測定，同時其含量比較低級，而采用液相芯片技術(shù)檢測可很好的解決這一問題，上面的研究顯示液相芯片技術(shù)已成為當(dāng)前檢測細胞因子主流技術(shù)。

2.2在腫瘤標(biāo)志物檢測方面的應(yīng)用 腫瘤標(biāo)志物（Tumor Marker）是反映腫瘤存在的化學(xué)類物質(zhì)。它們或不存在于正常成人組織而僅見于胚胎組織，或在腫瘤組織中的含量大大超過在正常組織里的含量，它們的存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì)，借以了解腫瘤的組織發(fā)生、細胞分化、細胞功能，以幫助腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷以及治療指導(dǎo)。目前臨床上檢測腫瘤標(biāo)記物主要用于腫瘤的早期診斷、治療、監(jiān)測及預(yù)后判斷。而現(xiàn)在常用的血清腫瘤標(biāo)志物的檢測主要采用放射免疫分析、ELISA及最近十幾年開展起來的化學(xué)發(fā)光與時間分辨熒光技術(shù)等，但這些方法存在缺陷，①由于采用的是異相免疫測定，對實驗結(jié)果存在一定的誤差，②每次實驗僅能檢測一種腫瘤標(biāo)志物。而液相芯片的出現(xiàn)可以彌補這方面的缺陷。但其與化學(xué)發(fā)光相比自動化程度有待提高。

梁惠儀，彭娟，李明[11]等采用液體芯片技術(shù)測定人體血清CEA、AFP、NSE和tPSA，其建立的人血清CEA+AFP+tPSA+NSE的液相芯片檢測方法，可在2～3 h內(nèi)聯(lián)合定量測定1～2 uL人血清中的CEA、AFP、NSE、tPSA水平，該方法操作簡單、快速、靈活、靈敏度高（達到pg級）、重復(fù)性好（CV<14%）、檢測范圍廣（3～5個數(shù)量級），與采用CLIA方法所測得值的相關(guān)性良好。在血清腫瘤標(biāo)志物的檢測方面還有：彭娟、陳瑋、陳瑋、楊洋等分別對采用液相芯片技術(shù)聯(lián)合檢測人血清CEA、AFP和NSE、聯(lián)合測定人血清CEA、AFP和tPSA、聯(lián)合測定人血清CEA、AFP和HBsAg及甲胎蛋白的液相芯片法檢測等進行了方法學(xué)評價。結(jié)果顯示采用液相芯片技術(shù)在檢測血清腫瘤標(biāo)志物方面具有快速（2～3 h）、靈敏度好、重復(fù)性好等優(yōu)點；與化學(xué)發(fā)光法相比具有良好的相關(guān)性。和化學(xué)發(fā)光法一樣成為臨床檢測腫瘤標(biāo)志物的常規(guī)方法。

在其他腫瘤應(yīng)用方面：婁加陶[12]、鄭召玲[13]、劉曉燕與胡搖沁[14]、鄧小梅等分別采用液相芯片技術(shù)檢測了肺癌、婦科腫瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌、宮頸癌中相關(guān)的癌基因。同時采用液相芯片技術(shù)對腫瘤用藥的檢測提供了支撐。

2.3在病原體檢測方面的應(yīng)用 在病原體的檢測方面國內(nèi)主要采用液相芯片法檢測細菌的耐藥基因如王清[15]和夏成靜等分別建立了采用液相芯片快速檢測結(jié)核耐藥基因和常見細菌大環(huán)內(nèi)酯類和β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因的方法。周林甫等采用液相芯片技術(shù)檢測了隱球菌性與病毒性腦炎患者腦脊液中相關(guān)細胞因子，為臨床治療提供方向。江蘇大學(xué)朱虹碩士與廣東醫(yī)學(xué)院夏成靜碩士分別采用液相芯片技術(shù)研究了幽門螺桿菌相關(guān)蛋白基因與臨床常見細菌大環(huán)內(nèi)酯類和β內(nèi)酰胺酶類耐藥基因。為臨床的藥物治療提供一種新的檢測方法，為臨床的苛養(yǎng)菌的藥物敏感試驗提供了一種新的方法。

在病毒感染的疾病方面：汪毅、劉利軍、劉紅艷等采用液相芯片技術(shù)分別檢測了乙肝DNA、抗體和HBV變異株，分別從蛋白質(zhì)和核酸水平對乙型肝炎病毒進行了檢測；而羅光成[16]等采用液相芯片技術(shù)檢測了乙型肝炎患者體內(nèi)的細胞因子與疾患的關(guān)系。鄧小梅、劉思瑤[17]、劉敏等采用液相芯片法對HPV病毒感染的疾病進行了相關(guān)檢測，為預(yù)防宮頸癌的發(fā)生提供了一種早期診斷依據(jù)。針對新型病毒領(lǐng)域，液相芯片技術(shù)的應(yīng)用也有報道，如夏駿等采用液相芯片技術(shù)設(shè)計針對禽流感病毒H5N1亞型的檢測方法。隨著相關(guān)研究的不斷開展，在病原學(xué)方面用以前檢測手段不能進行檢測的領(lǐng)域，現(xiàn)在采用液相芯片技術(shù)進行檢測均可取得令人較滿意的結(jié)果。

2.4在基因檢測方面的應(yīng)用 自從人類基因組工程研究以來，各種由于基因突變引起疾病越來越引起人們的注意。而由于單個核苷酸改變引起DNA序列的多態(tài)性是人類遺傳變異中最常見的一種，特別是隨著生態(tài)污染的加重，這種生物突變更是成為一種常態(tài)。因此單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的檢測已經(jīng)成為一個熱門的研究課題。

常用的技術(shù)手段包括：DNA分子雜交、引物延伸、等位基因特異的寡核苷酸連接反應(yīng)、側(cè)翼探針切割反應(yīng)以及基于這些方法的變通技術(shù)，這些方法檢測都比較繁煩，實驗中的誤差比較大，不能作為常規(guī)使用。而液相芯片技術(shù)的出現(xiàn)，只需要在擴增的基礎(chǔ)上，對擴增產(chǎn)物采用液相芯片進行分析即可，實驗變得簡單，易掌握、結(jié)果穩(wěn)定可靠。在國內(nèi)有多人，從各個方向?qū)Υ诉M行了研究：鄭麗霞[18]等采用液相芯片技術(shù)檢測了非小細胞肺癌患者的EGFR基因突變，發(fā)現(xiàn)采用液相芯片法相對于原先的PAGE銀染顯色，自動化程度顯著提高，檢測過程只需要約30 rain，可同步檢測占90%以上的EGFR基因2種關(guān)鍵突變類型，靈敏度可達10個拷貝（0.1%），接近EGFR基因突變的檢測極限0.05%。王歡、俞永康[19]、劉思瑤、汪棟、孫凱、袁定芬等分別從男性不育、食管鱗癌、非小細胞癌、尖銳濕疣等方面采用液相芯片技術(shù)對相關(guān)基因突變進行了研究。婁加陶[20]等則詳細研究了液態(tài)芯片與PCR-LDR對K-ras基因分型的關(guān)系；作者通過研究發(fā)現(xiàn)液相芯片技術(shù)檢測靈敏度為10%～20%，高于傳統(tǒng)測序法的1%。平均CV值<1%，表現(xiàn)出很好的重復(fù)性。從100例NSCLC患者組織樣本中共檢出5例突變，其中3例為Glyl2Val突變，2例為Glyl2Asp突變。而鐘鍵等通過采用液相芯片法檢測人HLA相關(guān)基因從而為腎移植術(shù)后監(jiān)測提供了依據(jù)。

除了上述應(yīng)用以外，液相芯片技術(shù)還可用于激素、炎癥因子中醫(yī)癥型[21]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病、及自身抗體、研究酶/底物與分析蛋白表達等方面。

3結(jié)論

近年來，液相芯片技術(shù)作為一種新檢測技術(shù)進展迅速。液態(tài)芯片以其高通量、準(zhǔn)確、快速、靈敏、特異性、多重檢測、操作簡便等顯著性優(yōu)點成為一種新型的大規(guī)模生物檢測平臺。特別是Luminex系統(tǒng)，現(xiàn)在已有國產(chǎn)化商品試劑；同時研發(fā)、配備了自動化的加樣、孵育平臺，使實驗更加自動化、結(jié)果更準(zhǔn)確。但與化學(xué)發(fā)光比，每批標(biāo)本均需定標(biāo)是其明顯缺陷，而隨著商品化試劑的開發(fā)，同時其樣品處理平臺的進一步完善，可以逐步改變這種狀況，使其成為一種常規(guī)使用的高效、高質(zhì)和廉價的實驗室檢測平臺，具有廣闊的發(fā)展及應(yīng)用前景。

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編輯/肖慧