殼聚糖—聚乳酸阿霉素膠團(tuán)的制備及含量測定

摘要：目的 合成并考察殼寡糖-聚乳酸嫁接物及其膠團(tuán)的理化性質(zhì)，熒光測定阿霉素膠團(tuán)的載藥量。方法 采用纖維素酶對殼聚糖進(jìn)行降解，制備低分子量殼聚糖、殼寡糖。以碳二亞胺為交聯(lián)偶合劑合成殼寡糖-聚乳酸聚合物，超聲分散法制備嫁接物膠團(tuán)；微粒粒度及表面電位儀測定其粒徑和表面電位；以阿霉素為模型藥物，考察膠團(tuán)對藥物的增溶能力、藥物包封率、載藥量。結(jié)果 在殼寡糖-聚乳酸嫁接物中，殼寡糖分子量為20000、聚乳酸分子量為5000的嫁接物平均粒徑最小，藥物包封率最高；聚乳酸分子量為5000殼寡糖-聚乳酸嫁接物載藥膠團(tuán)載藥量較高。結(jié)論 殼寡糖-聚乳酸聚合物膠團(tuán)是一種良好的抗腫瘤藥物載體，本方法可用于阿霉素膠團(tuán)中阿霉素的含量測定

關(guān)鍵詞：阿霉素；聚合物膠團(tuán)；藥物載體

在藥劑學(xué)領(lǐng)域中，具有病灶組織、細(xì)胞靶向控釋給藥系統(tǒng)[1]可提高藥物的穩(wěn)定性以及藥物的生物利用度，是當(dāng)前的熱點(diǎn)研究之一；通過藥物載體材料的被動靶向與在此基礎(chǔ)上的主動靶向配體修飾技術(shù)，可實現(xiàn)藥物的靶向治療，在最大限度提高藥物本身療效的同時，減少因藥物分子在體內(nèi)的非靶向分布所造成的毒副作用。聚合物膠團(tuán)[2]作為一種藥物傳輸系統(tǒng)，可以控制藥物在生物體內(nèi)的釋放；可穿過血腦屏障、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)，達(dá)到被動靶向的目的；聚合物膠團(tuán)骨架對藥物的保護(hù)和屏蔽作用，可在一定程度上避免藥物的分解，保持藥物的穩(wěn)定性，降低藥物的毒性；與脂質(zhì)體相比，聚合物膠團(tuán)的載藥量較高；聚合物材料的多樣性，使得以聚合物為載體的藥物制劑亦多樣化，能滿足各種使用需求。

殼聚糖[3]是一類由氨基葡萄糖組成的陽離子聚合物，具有很好的生物相容性、低毒性和可生物降解性，廣泛應(yīng)用于藥物載體材料的研究。但由于殼聚糖的高分子量，高粘性以及在生理pH條件下不溶等這些缺點(diǎn)，增加了殼聚糖微粒和納米粒的制備難度，以及限制了疏水改性殼聚糖膠團(tuán)的應(yīng)用。聚乳酸（ PLA）是一種無毒，可生物降解的聚合物[4-5]， 具有很好的生物相容性，是美國食品和藥物管理局（ FDA）認(rèn)可的一類生物醫(yī)用材料。作為疏水材料可與親水性的材料合成的嵌段共聚物。

本研究通過殼寡糖的氨基與聚乳酸的羧基之間的偶合反應(yīng)合成殼寡糖-聚乳酸嫁接物，并以超聲分散法制備殼寡糖-聚乳酸嫁接物膠團(tuán)；研究不同分子量殼寡糖和不同分子量的聚乳酸的殼寡糖-聚乳酸嫁接物膠團(tuán)的粒徑、粒徑分布、表面Zeta電位、臨界膠團(tuán)濃度等理化性質(zhì)；以親脂性抗腫瘤藥物阿霉素為模型藥物，考察嫁接物膠團(tuán)的藥物增容能力、藥物包封率、載藥量。

1 資料與方法

1.1儀器 電子天平（JA2003，上海楚定分析儀器有限公司），超濾離心管（Microcon YM-10，MWCO 10，000，Millipore Co.，USA），透析袋（MWCO 3500da， Spectrum Laboratories， Laguna Hills， CA），高效液相色譜儀（Agilent 1260， USA），微粒粒度與表面電位測定儀（3000HS， Malvern Co.， UK），熒光分光光度計（F-4600，HITACHI Co.， Japan），冷凍干燥機(jī)（FD-1D-50，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司），低速離心機(jī)（BK-TDZ4-WS，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司），超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（JY98-ⅢDN，寧波新芝科器研究所）

1.2材料 殼聚糖（分子量450 KDa，95 %脫乙酰度，浙江玉環(huán)海洋生物化學(xué)有限公司），纖維素酶（CP Power，中國科技開發(fā)研究院浙江分院），碳二亞胺（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide， EDC， Sigma Chem.Co， St.Louis， MO USA），芘（Aldrich Chem.Co.，USA），端羧基聚乳酸（分子量5000，10000；山東省醫(yī)療器械研究所），鹽酸阿霉素（Adriamycin.HCl，Adr，浙江海正藥業(yè)股份有限公司），其它溶劑或試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1殼寡糖的制備 稱取殼聚糖25g倒入燒杯，加750ml水和9.4ml鹽酸，在55℃下攪拌溶脹2h后，加入1.25g殼聚糖酶，控制攪拌速度、反應(yīng)溫度和時間制備不同分子量的低分子量殼聚糖（殼寡糖）。待反應(yīng)結(jié)束后，加入5 %活性炭，80℃條件下攪拌30min，使酶失活，冷卻至室溫后，4000r·min-1離心10min，分離活性炭，上清液用微孔濾膜處理完全除去活性炭后，噴霧干燥，即得殼寡糖，密封低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2殼寡糖分子量測定 本研究采用凝膠滲透色譜法（GPC）測定殼寡糖的分子量。

凝膠滲透色譜條件：色譜柱：TSK-gel G3000 SW；流動相：0.1 M 醋酸鈉（用醋酸調(diào)pH至6.0）；柱溫：25 ℃；檢測器溫度：35 ℃；進(jìn)樣量：10μl；流速：0.8 ml·min-1。以分子量為0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.0 Kda的葡聚糖標(biāo)樣制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，用該標(biāo)準(zhǔn)曲線計算殼寡糖分子量。

1.3.3殼寡糖-聚乳酸嫁接物（CSO-PLA）的合成 取0.1g殼寡糖，精密稱定，加2ml純水溶解，水浴恒溫在80℃。另稱取適量聚乳酸溶于20mlDMF中。將上述兩溶液混合后，80℃恒溫。稱取EDC適量溶于適量純水中，以一定的時間間隔在80℃的殼寡糖聚乳酸混合溶液中加入定量的EDC水溶液。以開始加入EDC水溶液的時間作為嫁接反應(yīng)的開始時間，在400r·min-1的磁力攪拌條件下反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)液經(jīng)冷卻后，將反應(yīng)液置于透析袋中（MWCO 3500 Da， Spectrum Laboratories， Laguna Hills， CA）透析48h，以除去水溶性副產(chǎn)物，然后將透析液冷凍干燥。通過控制反應(yīng)物的分子量及投料比，制備各種不同殼寡糖分子量和聚乳酸分子量的的殼寡糖-聚乳酸嫁接物，備用。

1.3.4嫁接物膠團(tuán)的制備 取10mg嫁接物精密稱定，溶解于5ml蒸餾水，探頭超聲20次（400w，工作2s停3s），用蒸餾水定容至10ml，得到1mg·ml-1的膠團(tuán)溶液。

1.3.5嫁接物膠團(tuán)的理化性質(zhì)評價

1.3.5.1嫁接物膠團(tuán)粒徑與表面電位測定 制備嫁接物濃度為1mg·ml-1的嫁接物膠團(tuán)溶液（方法同2.4），以微粒粒度與表面電位測定儀分別測定嫁接物膠團(tuán)的粒徑與表面電位。

1.3.5.2 嫁接物膠團(tuán)對阿霉素的增溶能力的考察 分別配制濃度為1 mg·ml-1的嫁接物膠團(tuán)溶液20ml置釋放管中，加入5mg左右的藥物，在37℃、振蕩頻率為60 r·min-1條件下進(jìn)行。分別在1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、72h取樣。離心除去未增溶的藥物（10000 r·min-1，10 min），取上清液0.2ml，加入0.8ml甲醇，以甲醇：水=4：1（v：v）溶液稀釋至適當(dāng)濃度測定其熒光強(qiáng)度，測定嫁接物膠團(tuán)的增溶能力。

1.3.6阿霉素載藥膠團(tuán)的制備 取阿霉素 5mg溶于10mlDMSO中。取10mg嫁接物，精密稱定，加入10ml蒸餾水，探頭超聲20次（400W，工作2s停3s），用蒸餾水定容至10ml，得1 mg·ml-1的嫁接物膠團(tuán)溶液。

移取嫁接物膠團(tuán)溶液5ml，加入5ml阿霉素DMSO溶液，置于透析袋（MWCO 3500 Da， Spectrum Laboratories， Laguna Hills， CA）中，外相為1L純水，在磁力攪拌條件下透析6h。離心除去未增溶的藥物（4000 r·min-1，10 min），得到嫁接物載藥膠團(tuán)溶液。

1.3.7嫁接物載藥膠團(tuán)粒徑與表面電位測定 取嫁接物載藥膠團(tuán)溶液適量，以微粒粒度與表面電位測定儀分別測定嫁接物載藥膠團(tuán)的粒徑與表面電位。

1.3.8嫁接物載藥膠團(tuán)的藥物包封率、載藥量。

1.3.8.1 阿霉素的含量測定 采用熒光分光光度法測定阿霉素的含量。

采用逐步稀釋法制備藥物在純水、甲醇：水=4：1（v：v）和pH=7.4的PBS三種溶劑中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。激發(fā)波長為471 nm，發(fā)射波長為558 nm。激發(fā)狹寬和發(fā)射狹寬設(shè)置為5 nm。

1.3.8.2嫁接物載藥膠團(tuán)的藥物包封率、載藥量測定 采用超濾離心法考察嫁接物載藥膠團(tuán)的藥物包封率。取0.5mg·ml-1的載藥膠團(tuán)溶液0.2ml，加入0.8ml甲醇，破壞膠團(tuán)后，以甲醇：水=4：1（v：v）溶液稀釋至適當(dāng)濃度，用熒光分光光度法測定藥物總濃度（Co）。另移取載藥膠團(tuán)溶液0.2 ml，置0.4 ml超濾離心管中（Microcon YM-10，MWCO 10，000，Millipore Co.，USA），10，000 r·min-1的速度離心10min，以純水稀釋至適當(dāng)濃度，用熒光分光光度法測定濾液中游離藥物濃度（C）。按（2.1）式和（2.2）式分別計算藥物包封率和載藥量。藥物濃度Co和C的單位為μg·ml-1。

包封率（%）=（Co-C）/ Co ×100% （2.1）

載藥量（%）=（Co-C）/（500+Co-C） ×100% （2.2）

2 結(jié)果

2.1殼聚糖的水解 本研究采用纖維素酶對殼聚糖進(jìn)行降解制備得到的殼寡糖的重均分子量分別為8000、14000、20000 Da。

2.2殼寡糖-聚乳酸嫁接物的制備 本研究通過使用不同分子量的殼寡糖（重均分子量8000、14000、20000Da）與不同分子量的聚乳酸（分子量為5000，10000），以殼寡糖上的氨基與聚乳酸的羧基之間的偶合反應(yīng)，制備了投料比不同的不同殼寡糖分子量和聚乳酸的殼寡糖-聚乳酸嫁接物。反應(yīng)物的分子量，產(chǎn)量和產(chǎn)率及溶解性見表1。

2.3 殼寡糖-聚乳酸嫁接物膠團(tuán)的理化性質(zhì)

2.3.1嫁接物膠團(tuán)粒徑與表面電位測定 由2.2，選擇水溶性好的四種嫁接物。取10 mg CSO-PLA嫁接物，精密稱定，溶解于5ml蒸餾水，探頭超聲20次（400W，工作2s停3s），定容至10ml，得到1 mg·ml-1的膠團(tuán)溶液。

2.3.2嫁接物膠團(tuán)對阿霉素堿基的增溶能力的考察 阿霉素堿基在PBS中的溶解度約為3μg·ml-1。為考察殼寡糖-聚乳酸嫁接物的藥物負(fù)載能力，本研究采用共孵育法測定了藥物在CSO（14000）-PLA（10000）嫁接物中的溶解度。其結(jié)果為36.6μg·ml-1，為在PBS中溶解度的12倍。

2.4 CSO-PLA載藥膠團(tuán)的粒徑與表面電位 本研究采用0.5mg·ml-1的嫁接物膠團(tuán)溶度，進(jìn)行阿霉素堿基的載藥實驗。以嫁接物膠團(tuán)的粒徑與表面電位以及嫁接物載藥膠團(tuán)的粒徑與表面電位結(jié)果見表2。

2.5 CSO-PLA載藥膠團(tuán)的藥物包封率以及體外釋放

2.5.1 阿霉素的含量測定 本實驗采用熒光分光光度法測定阿霉素的濃度，將熒光強(qiáng)度I與阿霉素的濃度C（ng·ml-1）進(jìn)行回歸，采用逐步稀釋法得到藥物在純水、甲醇：水=4：1（v：v）和pH=7.4的PBS中熒光強(qiáng)度I對阿霉素的濃度C的標(biāo)準(zhǔn)曲線，三條標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y=0.3307X+0.2749，R2=0.9996（阿霉素范圍10～5000 ng·ml-1） 、Y=0.5138X+34.506，R2=0.9993（阿霉素范圍10～5000 ng·ml-1）和Y=0.0.3722X+10.779，R2=0.9996（阿霉素范圍10～1000 ng·ml-1）有很好的線性相關(guān)性。

2.5.2 阿霉素載藥膠團(tuán)的包封率測定 采用超濾離心法測定的阿霉素在藥膠團(tuán)的藥物包封率結(jié)果見表3。

3 討論

殼寡糖有兩個活性基團(tuán)可以用于化學(xué)嫁接，一個是脫去乙?；稽c(diǎn)上的氨基，另一個是殼寡糖鏈上的羥基。通過嫁接反應(yīng)可以將多肽、羧基等引入到殼寡糖上，賦予殼寡糖新的性能[6]。本實驗中的反應(yīng)主要通過殼寡糖主鏈上的氨基與聚乳酸上的羧基形成酰胺鍵而達(dá)到修飾殼寡糖的目的。殼寡糖-聚乳酸嫁接物（CSO-PLA）的長鏈上既保持了親水性的氨基，又增添了疏水性的烷基鏈，具有兩親性，在水性環(huán)境中，其疏水基將自動躲避溶劑以降低自由能，形成疏水基聚集的內(nèi)核；親水鏈分散于外層，形成親水性外殼。通過微粒粒度與表面電位儀測得CSO-PLA膠團(tuán)的粒徑和表面電位。當(dāng)殼寡糖的分子量相同時，隨著聚乳酸分子量的增加，嫁接物分子變大，所以膠團(tuán)粒徑變大。同時其表面電位變化不大。

殼聚糖化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有大量氨基，本身帶正電荷。部分氨基被烷基取代后的聚合物，仍然保留了相當(dāng)數(shù)量的氨基，所形成的膠團(tuán)，其表面電位仍為正值。當(dāng)聚乳酸的分子量為10000時，隨著殼寡糖分子量的增大，由于嫁接物分子變大，使得膠團(tuán)粒徑變大。但當(dāng)聚乳酸的分子量為5000時，隨著殼寡糖分子量的增大，膠團(tuán)粒徑反而變小，其原因有待進(jìn)一步研究。產(chǎn)物中CSO（20000）-PLA（5000）粒徑最小。CSO-PLA載藥膠團(tuán)的粒徑較載藥前都大大減小，這說明大量藥物已經(jīng)進(jìn)入膠團(tuán)的疏水性內(nèi)核后，膠團(tuán)分子中的疏水性鏈段與親脂藥物之間的疏水性相互作用增加了膠團(tuán)的聚合能力，從而使膠團(tuán)體積減小。

當(dāng)聚乳酸的分子量一定時，隨著殼寡糖分子量的增加，其包封率和載藥量有所提高。

由化學(xué)嫁接得到的兩親性殼寡糖-聚乳酸聚合物，在水性環(huán)境中可自發(fā)形成膠團(tuán)。這種聚合物膠團(tuán)具有比較低的臨界聚集濃度和較小的粒徑。以抗腫瘤藥物阿霉素為模型藥物，發(fā)現(xiàn)該聚合物可以作為疏水性藥物的儲庫，具有一定的載藥能力。

參考文獻(xiàn)：

[1]張浩，孫健.靶向給藥系統(tǒng)的研究發(fā)展[J].山東畜牧獸醫(yī)，2012（7）：78-80.

[2]許鴦雁，牛泱平.聚合物膠團(tuán)在腫瘤治療中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2010，26（17）.

[3]林水森，李明春，辛梅華，等.殼聚糖及其衍生物抗菌機(jī)理研究進(jìn)展[J].化學(xué)通報，2014（3）：220-226.

[4]張國棟，楊紀(jì)元，馮新德，等.聚乳酸的研究進(jìn)展[J].化學(xué)進(jìn)展，2000，12（1）：89-102.

[5]馬強(qiáng)，楊青芳，姚軍燕.聚乳酸的合成研究[J].高分子材料科學(xué)與工程，2004，20（3）34-35.

[6]LI Y H，HU F Q，YUAN H.Preparation and release profiles of chitosan oligosaccharide grafted stearic acid nanoparticles in vitro[J].Chinese Pharmaceutical Journal，2005，40（14）：1083.

編輯/哈濤