川芎嗪對(duì)SD大鼠SAH后腦的保護(hù)作用

摘要：目的 研究川芎嗪（TMP）在SAH后腦的保護(hù)作用。方法 健康成年SD大鼠45只隨機(jī)分為三組（n=15）。①A為對(duì)照組；②B為SAH組；③C為SAH+TMP組。B、C兩組均用自體動(dòng)脈血兩次注入于枕大池制作成SAH模型，C組用川芎嗪處理。各組均在第7d處死。結(jié)果 在光鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元，三組存在明顯差異。免疫組化染色切片見bcl-2在C組較B組陽性細(xì)胞數(shù)多且強(qiáng)；而bax則相反。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析后，各組神經(jīng)元凋亡數(shù)目、Bcl-2、bax表達(dá)強(qiáng)度存在顯著性差異（P<0.05）。結(jié)論 川芎嗪對(duì)SAH后對(duì)腦組織具有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞： 蛛網(wǎng)膜下腔出血；川芎嗪； Bcl-2 Bax

腦血管痙攣（CVS ）是SAH后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，常引起嚴(yán)重腦組織缺血，細(xì)胞源性腦水腫，導(dǎo)致顱高壓，產(chǎn)生腦神經(jīng)功能損傷，甚至導(dǎo)致腦梗死。腦缺血時(shí)，可產(chǎn)生一系列的病理生理變化而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞及缺血區(qū)神經(jīng)元損傷、凋亡。川芎嗪[1]具有防治腦血管痙攣，改善腦供血，同時(shí)具有抗炎癥反應(yīng)等多種生理和藥理作用。TMP在動(dòng)物腦缺血中已有深入研究[2]，但在SAH后對(duì)腦的保護(hù)作用機(jī)制報(bào)道甚少。

Bax與Bcl-2在同一細(xì)胞共同表達(dá)時(shí)，Bax可拮抗Bcl-2的抗凋亡作用。Bax可與Bcl-2結(jié)合形成異型二聚體，而且Bax與Bcl-2的比例可能是決定細(xì)胞是否會(huì)凋亡的關(guān)鍵 [4]。故本次實(shí)驗(yàn)選擇了Bax和Bcl-2作為觀察指標(biāo)，研究TMP的腦保護(hù)機(jī)制。

1資料與方法

1.1一般資料 健康成年SD大鼠45只（由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物學(xué)部提供），體重（200±20）g，隨機(jī)分為A、B、C 3組： A為對(duì)照組；B為SAH組，用于病理對(duì)照；C為SAH+TMP組：對(duì)SAH模型每天經(jīng)腹腔注人川芎嗪20mg直至動(dòng)物處死。

1.2方法

1.2.1 SD大鼠SAH模型的制備 取健康SD大鼠，以0.3%的戊巴比妥0.25ml腹腔內(nèi)注射麻醉。①于枕骨至頸2棘突間切開各層，顯露環(huán)枕筋膜后，用1ml注射器從枕大池內(nèi)緩慢抽出0.2ml腦脊液。②分離股動(dòng)脈后用1ml注射器（不加抗凝劑）抽取自體股動(dòng)脈血約0.2ml，緩慢注入枕大池內(nèi)，置頭低尾高位（傾斜角為30°）30min。48h后再次重復(fù)上述操作，完成SAH模型制備。

1.2.2川芎嗪實(shí)驗(yàn)組 從第一次從枕大池注入股動(dòng)脈血的當(dāng)天開始，1次/d從腹腔內(nèi)注入川芎嗪20mg制成C組。

1.2.3動(dòng)物標(biāo)本的制做 將動(dòng)物麻醉后，開胸將4%多聚甲醛PBS溶液經(jīng)心主動(dòng)脈灌注固定后，開顱分離出海馬。將標(biāo)本放入4%多聚甲醛溶液中固定約24h，然后常規(guī)固定，包埋，切片。

1.2.5免疫組化檢測(cè)Bcl-2、Bax Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞主要為胞質(zhì)著色，分別呈棕色及黃色，均勻彌漫染色。其表達(dá)與染色程度呈正相關(guān)，計(jì)數(shù)方法為：將H-E染色切片在400倍光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)取海馬CAI區(qū)6個(gè)視野，數(shù)視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 選擇單變量多因素的方差分析。多個(gè)樣本均數(shù)兩兩之間的比較采用q檢驗(yàn)。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS18進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并定義P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況 正常神經(jīng)元示大小較均一，呈圓形或橢圓形且有突起，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞核大深染黑色，胞漿色澤呈淡紅色。而凋亡的錐體細(xì)胞的細(xì)胞體積明顯較小且不規(guī)則，細(xì)胞漿呈紅染，細(xì)胞核染色質(zhì)集聚團(tuán)塊狀或顆粒狀，細(xì)胞失去正常形態(tài)。

注：C組與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05），與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05）。

2.2 免疫組化染色觀察結(jié)果

2.2.1 Bcl-2的陽性表達(dá)結(jié)果 Bcl-2陽性細(xì)胞在在A組海馬神經(jīng)元中幾乎無表達(dá)， C組bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)較B組細(xì)胞數(shù)多且較強(qiáng)， B、C組比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2.2 Bax的陽性表達(dá)結(jié)果 Bax陽性細(xì)胞在A組海馬神經(jīng)元中幾乎無表達(dá)， C組bax陽性細(xì)胞數(shù)均低于B， B、C組比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3討論

神經(jīng)細(xì)胞凋亡[3]可以發(fā)生在腦缺血，腫瘤，腦損傷及神經(jīng)退化性疾病等情況下。是通過啟動(dòng)其自身內(nèi)部機(jī)制而發(fā)生的細(xì)胞自殺性死亡過程。凋亡有別于壞死，凋亡是受機(jī)體本身因素控制的一種死亡，細(xì)胞其內(nèi)容物不是經(jīng)細(xì)胞膜的破潰外逸，而是被吞噬細(xì)胞吞噬，因此不會(huì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)現(xiàn)象，這是一種基因控制的細(xì)胞有序性死亡。

神經(jīng)元凋亡發(fā)生發(fā)展過程中，bcl-2家族、caspase家族起重要作用[4]。Bcl-2家族是與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因中最受關(guān)注的基因之一， Bcl-2蛋白家族成員在細(xì)胞凋亡中起兩種截然相反的作用。因而據(jù)其功能分為兩大類，一類為促生存家族（Bcl-2、Bak等）；另一類為促凋亡家族（Bax、Bok等）。Bax高表達(dá)使線粒體細(xì)胞色素C釋放，致使Caspases-3和Caspases-9激活而誘導(dǎo)凋亡；而Bcl-2與Bax結(jié)合，使其失去活性起到保護(hù)作用。而BH3類被激活后可以誘發(fā)Bax激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，啟動(dòng)caspase酶系級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]。

本實(shí)驗(yàn)觀察到在B、C組海馬CA1區(qū)Bcl-2表達(dá)明顯，C組較B兩組陽性細(xì)胞數(shù)多且較強(qiáng)。Bax在C組較B組陽性細(xì)胞數(shù)少且較弱。說明SAH可導(dǎo)致Bcl-2和Bax的表達(dá)。C組中川芎嗪明顯促使了Bcl-2的表達(dá)，而抑制了Bax的表達(dá)，從而提高了Bcl-2/Bax比率， 啟動(dòng)抗凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡來發(fā)揮腦保護(hù)作用。因此，TMP通過對(duì)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響可能是其抗凋亡作用機(jī)制之一。

當(dāng)然TMP還具有：抗自由基作用，抗組織纖維化作用，改善血液流變學(xué)的作用[6]，以及抗SAH后CVS的發(fā)生也可能發(fā)揮了重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床實(shí)踐效果相符[7]，進(jìn)一步證實(shí)了川芎嗪對(duì)SAH后具有腦保護(hù)作用。

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編輯/許言