大腸桿菌素對(duì)抗尿路感染的研究現(xiàn)狀與展望

摘要：臨床上多重耐藥菌株普遍出現(xiàn)的重要原因之一是廣譜抗生素的普遍使用；大腸桿菌是泌尿外科臨床中最常見也是最難治療的多重耐藥菌株之一，如何預(yù)防及治療大腸桿菌的感染、有效避免多重耐藥菌株的出現(xiàn)是迫在眉睫的臨床問題。大腸桿菌素由大腸桿菌產(chǎn)生，其抗菌譜窄，不易產(chǎn)生耐藥性，被視為有效的預(yù)防策略之一，很有可能成為新一代的抗菌藥物。本文綜述了重要的大腸桿菌素作為一種替代手段來預(yù)防、治療尿路各種大腸桿菌相關(guān)的感染，分析其抗尿路感染的前景及臨床應(yīng)用所面臨的問題。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；細(xì)菌素；大腸桿菌素；尿路感染；耐藥性

細(xì)菌素是由細(xì)菌產(chǎn)生的一種蛋白類抗菌物質(zhì)，為一類抗菌肽，通常只作用于與產(chǎn)生菌同種的其他菌株或親緣關(guān)系很近的菌株[1，2]。細(xì)菌通常會(huì)產(chǎn)生毒素來殺滅競爭細(xì)菌。大腸桿菌素就是由大腸桿菌產(chǎn)生并對(duì)近緣大腸桿菌產(chǎn)生毒性的一種細(xì)菌素，通過結(jié)構(gòu)蛋白殺死細(xì)菌[3]?，F(xiàn)就大腸桿菌素作用機(jī)理、臨床應(yīng)用價(jià)值與前景、面臨的問題等進(jìn)行文獻(xiàn)綜述。

1大腸桿菌素的生物學(xué)特點(diǎn)

大腸桿菌素是由大腸桿菌所分泌的毒性蛋白質(zhì)，對(duì)大腸桿菌及其相近菌種造成毒殺的效果[4]。到目前為止已經(jīng)描述的大腸桿菌素超過34種，報(bào)道較多的是：A、B、D、E1-E9、Ia、Ib、JS、K、M、N、U、5、10 等。一般情況下，他們相互作用到敏感細(xì)菌包括三個(gè)步驟[5]：①大腸桿菌素分子結(jié)合到細(xì)菌外膜的特定受體上；②通過細(xì)胞膜易位；③特定分子對(duì)靶細(xì)胞的致死作用。大腸桿菌素蛋白質(zhì)具有3種結(jié)構(gòu)域：運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域（主要負(fù)責(zé)把這種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)靶細(xì)胞）、受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（主要負(fù)責(zé)與目標(biāo)細(xì)胞特異受體相結(jié)合）、殺傷結(jié)構(gòu)域（主要通過小孔形成和核酸酶產(chǎn)生作用）。當(dāng)能產(chǎn)生細(xì)菌素的細(xì)胞開始合成殺傷結(jié)構(gòu)域時(shí)，殺傷結(jié)構(gòu)域首先和一種免疫蛋白相結(jié)合，這種免疫蛋白在移除之前起作安全帽的作用。殺傷的特異性是由受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來決定[6]。不同的大腸桿菌素其作用方式和抗菌效果也不盡相同，而不同的大腸桿菌素組合的抗菌效果也不相同。

2重要大腸桿菌素的抗尿路感染作用

由于細(xì)菌素是由細(xì)菌產(chǎn)生的高度特異的天然抗生素，只對(duì)產(chǎn)生細(xì)菌素菌株的近緣細(xì)菌有毒性作用[7]。人們開始著手研究大腸桿菌細(xì)菌素的抗大腸桿菌感染的作用及機(jī)理。重要的有以下幾種。

2.1大腸桿菌素E2預(yù)防導(dǎo)尿管所致尿路感染的作用 需要留置導(dǎo)尿管的患者會(huì)出現(xiàn)泌尿道病原體慢性感染和尿路感染的復(fù)發(fā)[8]，而長期留置導(dǎo)尿管會(huì)使尿道病原體形成生物膜，這種病原體在尿液中持續(xù)種植，細(xì)菌定植在生物膜上，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗菌劑有很強(qiáng)的抵抗作用[9]。因此，在長期留置導(dǎo)尿管的患者，抗生素不能有效的防止泌尿道感染，更加不利的是頻繁運(yùn)用抗生素會(huì)導(dǎo)致病原體耐藥性的出現(xiàn)，以及二重感染[10]。這促使人們尋找新的預(yù)防及治療方法。

有研究在瓊脂板上種植K-12，col+，37℃條件下培養(yǎng)過夜，然后暴露在氯仿中殺死該菌，在瓊脂平板上覆蓋108cfu/ml測試菌株（colS或者colR），培養(yǎng)過夜。結(jié)果表明：均勻的涂有ColS的瓊脂平板上可見清晰的抑菌帶（直徑>10mm）出現(xiàn)在K-12，col+接種周圍。ColS的抑菌帶沒有出現(xiàn)在K-12，col-周圍，均勻涂有ColR的瓊脂平板上亦沒有出現(xiàn)抑菌帶，證明ColS被質(zhì)粒陽性K-12所產(chǎn)生的大腸桿菌素E2殺死或者抑制。這說明：大腸桿菌K-12涂在導(dǎo)尿管上其產(chǎn)生的大腸桿菌素E2能完全預(yù)防對(duì)大腸桿菌素敏感的大腸桿菌在其上面的增殖[11]。

2.2大腸桿菌素K對(duì)抗尿路病原性大腸桿菌的作用 大腸桿菌素K對(duì)致腎盂腎炎大腸桿菌（UPEC）具有明顯的抑制活性[12]。大腸桿菌素K是編碼細(xì)菌形成小的孔隙，造成細(xì)菌死亡，有大腸桿菌素ColE1類似質(zhì)粒的細(xì)菌素。菌群中有三個(gè)基因編碼大腸桿菌素的產(chǎn)生和釋放：cka為編碼大腸桿菌素的活性，Cki為編碼免疫力，ckl為編碼細(xì)胞溶解[13]。

目前已有實(shí)驗(yàn)就大腸桿菌素K的抑菌量及效果進(jìn)行了研究。大腸桿菌素K在大腸桿菌菌株BL21中表達(dá)（DE3）[14]。按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的要求分離菌株，UPEC菌株的分離是從尿路感染尿液細(xì)菌培養(yǎng)>105CFU/ml。進(jìn)行5μm的各種濃度（0.1，1，10，和100μg/ml）的大腸桿菌素K在LB平板上進(jìn)行對(duì)UPEC菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)，在37°C培養(yǎng)過夜后，平板用于檢查大腸桿菌素對(duì)覆蓋菌株的敏感性。

結(jié)果表明，共有68%的測試UPEC菌株敏感和32%對(duì)大腸桿菌素K耐藥。然而，在敏感菌株中，對(duì)各種不同敏感性進(jìn)行觀察。結(jié)果，18%的菌株由0.1μg/ml抑制，3%的由1μg/ml抑制，16%由10μg/ml抑制，31%由100μg/ml的大腸桿菌素K抑制[12]?；谶@些敏感性的不同可能是由于在每個(gè)細(xì)胞上不同數(shù)量的受體[15]。對(duì)供試的UPEC菌株，大腸桿菌素K表現(xiàn)出明顯的抑制活性。

2.3大腸桿菌素E1是一個(gè)潛在的毒力因子 目前已經(jīng)在分子水平上分析了26種大腸桿菌素和9種小菌素，并確定相應(yīng)的基因。通過檢測從泌尿道感染的患者尿液中分離出來的一組361種大腸桿菌和從沒有腸道感染的患者糞便中分離出來的對(duì)照組中411種大腸桿菌，一共產(chǎn)生了29種細(xì)菌素。結(jié)果在泌尿道感染組和對(duì)照組中分別檢測到了17種和20種細(xì)菌素。與對(duì)照組相比，泌尿道感染組中有更多的大腸桿菌株產(chǎn)生大腸桿菌素E1（分別是22.1%和10.2%，P=0.0008）。更重要的是，在泌尿道感染組中產(chǎn)生大腸桿菌素E1的大腸桿菌具有產(chǎn)生多種細(xì)菌素的能力[16]。

在泌尿系統(tǒng)感染組中檢測到的361種大腸桿菌其中有195種（54.0%）產(chǎn)生細(xì)菌素，這與對(duì)照組的細(xì)菌素產(chǎn)生率（411種大腸桿菌其中有226種產(chǎn)生細(xì)菌素，占55.0%）沒有明顯的區(qū)別。產(chǎn)生單一細(xì)菌素與產(chǎn)生兩種細(xì)菌素的大腸桿菌在泌尿道感染組與對(duì)照組中分布相似。（產(chǎn)生一種大腸桿菌素的大腸桿菌分別為48.7%和45.6%，產(chǎn)生兩種細(xì)菌素的大腸桿菌的大腸桿菌分別占30.1%和28.2%）。具有編碼三種或三種以上細(xì)菌素的大腸桿菌在泌尿系統(tǒng)感染組中更常見（與對(duì)照組相比分別是20.0%和12.4%，P=0.03）[16]。

根據(jù)Jeziorowski和Gordon的研究表明[17]，當(dāng)大腸桿菌素Ia和小菌素V同時(shí)出現(xiàn)，他們被編碼在同樣的接合質(zhì)粒上，由于小菌素V操縱子和其他幾種基因整合在pColIa 質(zhì)粒上。因此，我們測試了是否相似的整合大腸桿菌素E1基因進(jìn)入到pColIa 可以解釋所觀察到的大腸桿菌E1和大腸桿菌素Ia合成的關(guān)系。在隨即挑選的12個(gè)大腸桿菌素E1多重產(chǎn)生者里面，所有菌株包含pColE1 DNA通過探針互補(bǔ)大腸桿菌素Ia編碼DNA不能被識(shí)別，反之亦然，表明在泌尿道感染的菌株中pColE1與pColIa不相關(guān)。更重要的是pColE1的分子量與以前的研究結(jié)果相似，（5.2kb；[18]9kb[19]）表明pColE1 DNA不可能編碼某種已知的毒力因子。這個(gè)研究結(jié)果表明在泌尿系統(tǒng)感染的大腸桿菌群中大腸桿菌素E1本身就是一種潛在的毒力因子[16]。

2.4結(jié)合不同大腸桿菌素的抗菌效果 細(xì)菌性菌血癥和敗血癥的出現(xiàn)是一個(gè)重要的臨床問題。超過40%的菌血癥病例，社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性，致病性大腸桿菌是引起死亡的主要原因，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。多數(shù)情況下，大腸桿菌敗血癥繼發(fā)于尿路感染。

大腸桿菌素的作用要通過不同的受體/轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，并表現(xiàn)出不同的作用機(jī)制，大腸桿菌素M抑制肽聚糖合成，E6引起rRNA水解，E7裂解DNA，E1和K形成孔隙，對(duì)抗一些從尿路起源菌血癥患者分離大腸桿菌菌株[20]。已知大腸桿菌產(chǎn)生兩種類型的細(xì)菌素，根據(jù)他們的分子量分為大腸桿菌素（25-80 kDa）和小菌素（10kDa）。大腸桿菌素和小菌素有很多相似的地方。與大腸桿菌素相比，小菌素的合成對(duì)產(chǎn)生株是非致命的，不是規(guī)定的通過DNA損傷誘導(dǎo)SOS系統(tǒng)。此外，幾乎所有的大腸桿菌素是質(zhì)粒編碼，而小菌素編碼基因也發(fā)現(xiàn)在染色體。 大腸桿菌素起作用的方式：①使膜通透性增加；②核酸酶活性；③抑制肽聚糖和脂多糖O-抗原合成[21]。他們的活動(dòng)需要結(jié)合外膜特定的受體和通過外膜從機(jī)械通道Tol 或TonB易位到靶位[22]。還分別測試了聯(lián)合三種（E7，K，M）和5種大腸桿菌素（E1，E6，E7，K，M）應(yīng)用的抗菌效果。研究結(jié)果表明，只有組合的大腸桿菌素表現(xiàn)出有效的抗菌活性，排除耐藥演變，小菌素可能導(dǎo)致尿路起源大腸桿菌菌血癥的發(fā)展。

測試分離的大腸桿菌素對(duì)抗從尿路起源性菌血癥患者105 株大腸桿菌菌株，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌素E7是最有效的，87%的測試菌株易感。另一方面，32%，33%，43%和53%的測試菌株表現(xiàn)出分別耐大腸桿菌素 E6，K，M和E1，對(duì)大腸桿菌素不同程度的易感性可能是由于每個(gè)細(xì)胞的大腸桿菌素受體數(shù)目的不同或由于通過脂多糖O-抗原鏈對(duì)受體的保護(hù)[23]。大腸桿菌素已被證明對(duì)大腸桿菌菌株是有效的，與腹瀉相關(guān)的包括血清型O157：H7同樣有效[24，25]。

對(duì)大腸桿菌素不敏感的原因包括：①基因突變，廢除或改變大腸桿菌素受體；②由于缺乏大腸桿菌素轉(zhuǎn)運(yùn)的功能系統(tǒng)。同時(shí)在兩個(gè)或多個(gè)的受體/轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)比一個(gè)單一的受體/易位系統(tǒng)更不可能突變。因此，為了判定是否結(jié)合大腸桿菌素使用不同的受體，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和作用方式可以提供有效的抗菌活性，分別結(jié)合大腸桿菌素 E7，K，M和E1，E6，E7，K，M在隨后的24h觀察其抑制活性。結(jié)合應(yīng)用三種大腸桿菌素，觀察到再生，當(dāng)新鮮大腸桿菌素僅用于生長周期的開始∕起始，每隔3h在生長周期各處阻止再生。另一方面，當(dāng)結(jié)合五種大腸桿菌素，沒有觀察到耐藥。

此研究表明，同時(shí)應(yīng)用3種或5種大腸桿菌素，能有效地抑制致病性大腸桿菌菌株的生長，并防止出現(xiàn)耐藥性[20]。但這些都做的體外抑菌實(shí)驗(yàn)，需要用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來證實(shí)其在體內(nèi)作用的效果。

3展望

大腸桿菌素具有較窄的抗菌譜，對(duì)人體有較高的安全性， 大腸桿菌素對(duì)致病性大腸桿菌有明確的抑制作用，大腸桿菌素可望被開發(fā)為新一代抗菌藥物，治療各種急慢性泌尿系統(tǒng)感染，包括孕期尿路感染，預(yù)防醫(yī)源性導(dǎo)尿管感染及長期使用導(dǎo)尿管的癱瘓患者的尿路感染。大腸桿菌素對(duì)治療細(xì)菌耐藥性尿路感染的研究有待進(jìn)一步深入，對(duì)大腸桿菌素的研究有望解決尿路細(xì)菌感染耐藥的難題。然而天然的大腸桿菌素從生物體內(nèi)直接提取純化通常產(chǎn)量低、難度大、效率低、難于制備，難于規(guī)?；a(chǎn)?？梢栽囍没蚬こ淘吮磉_(dá)、純化提取后進(jìn)行分析，從而建立生產(chǎn)體系，為新型抗菌藥物的生產(chǎn)提供有效的途徑，如何提高表達(dá)效率、減少成本成為基因工程原核表達(dá)技術(shù)有待解決的問題。而設(shè)想用最簡單的組合達(dá)到最好的抗菌效果，有待實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論。

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編輯/申磊