RP多糖體外抗乙型肝炎病毒作用研究

摘要：目的 觀察RP多糖在體外對HBV的抑制作用。方法 RP多糖設不同濃度組與HepG2.2.15細胞混合培養(yǎng)，同時設3-TC組和細胞對照組，采用CCK-8法檢測藥物對HepG2.2.15細胞的抑制作用，9d后通過ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中的HBsAg、HBeAg含量，用FQ-PCR檢測培養(yǎng)液中的HBV-DNA含量。結果 藥物濃度在小于1mg/mL時無明顯細胞毒性；在各稀釋濃度對HBsAg、HBeAg的分泌具有一定抑制作用，最大抑制率分別為50.9%和44.2%；HBsAg、HBeAg的治療指數(shù)分別大于14.66%、12.39%。藥物可抑制HBV-DNA的復制（P<0.05）。結論 RP多糖在體外具有抗HBV作用。

關鍵詞：菲律賓蛤仔多糖；HepG2.2.15細胞株；乙型肝炎病毒

盛產于我國南北沿海的菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum，RP），又稱雜色蛤、蛤蜊、花蛤，屬軟體動物門（Mollusca）、雙殼綱（Bivalvia）、簾蛤科（Veneridae），廣泛分布在近岸灘涂和淺海區(qū)。因它經(jīng)濟價值高，生長周期短，適應能力強，非常適合人工規(guī)模養(yǎng)殖，系我國傳統(tǒng)養(yǎng)殖的四大貝類之一。菲律賓蛤仔肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，除了食用，藥用自古就有記載。宋朝掌禹錫《嘉祐本草》：\"潤五臟，止消渴，開胃，解酒毒，主老癖能為寒熱者，及婦人血塊，煮食之。\"《本草求原》：\"消水腫，利水，化痰，治崩帶，癭瘤，五痔。\"其傳統(tǒng)功效為：滋陰清熱、安神定志、平肝潛陽、名目退翳、化痰止咳、軟堅散結、收斂固澀、利尿通淋、制酸止痛、強壯滋補等[1]。國內外學者近年來的研究表明，其具有抗腫瘤、抗炎、增強免疫力、降壓、降血脂、延緩衰老等藥理作用[2]。因其藥用功效顯著且價廉易得，本文以RP提取的多糖為研究對象，探討其體外抗乙型肝炎病毒作用。

1資料與方法

1.1藥物 RP多糖（本實驗室提取，將新鮮菲律賓蛤仔肉洗凈后勻漿，超聲波輔助熱水浸提法、乙醇沉淀法提取多糖，經(jīng)柱層析分離純化后得粗提物，經(jīng)莫立許反應和菲林反應鑒定，存在多糖成分，純度約為82.5%[3]）。拉米夫定（3-TC），葛蘭素史克公司生產。

1.2 HepG2.2.15細胞 中國科學技術大學生殖生物實驗室惠贈。

1.3試劑 胰蛋白酶：GIBCO公司；DMEM干粉：GIBCO公司；L-谷氨酰胺：京科化學試劑公司；胎牛血清：GIBCO公司；HBsAg、HBeAg 抗原檢測試劑盒：北京北方免疫試劑研究所；CCK-8試劑盒：北京伊普瑞斯公司；PCR試劑盒：華美生物工程公司；Chelex：Bio-Rad公司；HBV探針和引物：ABI公司；G-418：GIBCO公司。

1.4儀器 熒光定量PCR儀：Bio-Rad公司；振蕩器：Bio-Rad公司；高速冷凍離心機：Eppendorf公司；酶標儀：Perkin-Elmer公司；倒置顯微鏡：OLYMPUS公司；CO2細胞培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；超凈工作臺：蘇州3醫(yī)藥凈化設備廠；多標記微孔板檢測儀：Perkin-Elmer公司；多標記微孔板檢測儀：Perkin Elmer公司；超低溫冰箱：SANYO公司；細胞培養(yǎng)板（96/24孔）：Corning公司。

2方法

2.1 HepG2.2.15細胞株培養(yǎng) 取凍存的HepG2.2.15細胞，培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中（含0.03g/L L-谷氨酰胺、0.1g/L鏈霉素、100U/mL青霉素、10%胎牛血清、100mg/mL G-418，50g/L碳酸氫鈉調pH值至7.2），置于細胞培養(yǎng)箱內（37℃、5%CO2），每2～3d更換培養(yǎng)液。觀察細胞生長到70%～80%時，用胰蛋白酶（含EDTA）消化傳代，每次換液時留取上清液，檢測HBsAg、HBeAg和HBV-DNA水平，表達穩(wěn)定后進行實驗。

2.2細胞毒性實驗 藥物對HepG2.2.15細胞生長的抑制作用采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法[4]檢測。方法：取1瓶生長良好的HepG2.2.15細胞，經(jīng)胰酶消化后制成單細胞懸液，計數(shù)，調整細胞濃度至每毫升2×104個，按100μL每孔加入96孔細胞培養(yǎng)板中，各濃度均3復孔。把培養(yǎng)板放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待貼壁。將上清吸去，加入含不同濃度RP多糖的DMEM培養(yǎng)基（梯度為10、1、0.1、0.01、0.001mg/mL），另設細胞對照組。5%CO2、37℃環(huán)境作用48h后，加入WST-8（10μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4h，待培養(yǎng)基由粉色變?yōu)榉€(wěn)定的橙色，用酶標儀檢測各孔的OD450，每孔平行測定兩次取均值，結果以均數(shù)±標準差（x±s）表示。計算細胞存活率和藥物對細胞的半數(shù)毒性濃度TC50（按Reed -Muench法[5]計算），公示如下：

（OD1：藥物處理組OD值，OD2：細胞對照組OD值，OD3：空白對照組OD值）

（其中 A=log>50%藥物濃度，B=log<50%藥物濃度，C=A-B）

2.3藥物對HBsAg、HbeAg的抑制作用 HepG2.2.15細胞經(jīng)胰酶消化，制成單細胞懸液，按1mL每孔接種至24孔培養(yǎng)板（細胞濃度調至2×104個/mL），5%CO2、37℃環(huán)境培養(yǎng)。4d后取出培養(yǎng)板，吸去上清，以細胞毒性檢測結果為參照，分別加入10-4、10-3、10-2、10-1、1mg/mL濃度的藥物，另設細胞對照組、陽性藥物組（拉米夫定）和培養(yǎng)液空白對照組，每組3孔。第3、6d更換新鮮的含藥液培養(yǎng)，第9d收集各孔上清液，-20℃凍存待檢。檢測上清液中HBsAg、HBeAg含量用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA），計算藥物對抗原的抑制率，公式如下：

（OD1：藥物處理組OD值，OD2：細胞對照組OD值，OD3：空白對照組OD值）

2.4 HBV-DNA定量檢測 取備用的各孔細胞上清液，酚-氯仿抽提法提取HBV-DNA，熒光定量聚合酶鏈式反應（FQ-PCR）測定HBV-DNA的量。反應體系中加入以下試劑：模板1.0μl；Taq酶0.25μl；5×R-PCR Buffer 5.0μl；250mM Mg2+ 0.5μl；5 M探針1.2μ1；10 M引物1.0μl；10 M dNTP 0.75μl；補充ddH2O直到20μl。PCR擴增目的片段：115bp HBV基因區(qū) p區(qū) 292 ～407。擴增引物：HBVFP：5'-TGT-CCT-GGT-TAT-CGC-TGG -3'和HBVRP：5'- CAA-ACG-GGC-AAC-ATA-CCT-T-3'。TaqMan探針序列：FAM-5'-TGT-GTC-TGC-GGC-GTT-TTA-TCA T-3'-TAMRA。95℃條件下樣品預變性3.5min，之后94℃ 20s；60℃ 40s，共40個循環(huán)。在86℃檢測激發(fā)熒光，用iCycler iQ 3.1分析數(shù)據(jù)。

2.5藥物抗HBV效果的評價 用治療指數(shù)（Therapeutic Index，TI）評價藥物抗HBV活性。TI=TC50/IC50（IC50是抑制率為50%時的藥物濃度）。

A=log>50%藥物濃度，B=log<50%藥物濃度，C =A-B

TI<1，為毒性作用；1≤TI≤2，為低效有毒；TI>2，為有效低毒。即TI值越大，藥物對HBV的抑制作用越大，毒性越小[6]。

2.6數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)以 表示，均采用SPSS11.5軟件分析處理，用藥前后比較采用配對t檢驗，組間比較采用One-way ANOVA，兩組比較采用LSD，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

3結果

3.1藥物對HepG2.2.15細胞的毒性作用 由CCK-8試驗結果可知：小于1mg/mL濃度時，RP多糖、3-TC對HepG2.2.15細胞均無明顯毒性，細胞存活率均大于90%，因此選擇藥物濃度1mg/mL為上限來評價藥效。

3.2藥物對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg、HBeAg和HBV-DNA復制的抑制作用 相比于細胞對照組，10-3至1mg/mL濃度的RP多糖和3-TC，對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg、HBeAg及HBV-DNA復制均有一定的抑制作用，且抑制強度與藥物濃度呈相關性。10-3mg/mL除外的同濃度比較，3-TC對HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的抑制率均高于RP多糖，見表1。

3.3藥物對HBsAg和HBeAg的治療指數(shù) 藥效評價結果（表2）顯示，RP多糖和拉米夫定的治療指數(shù)都大于2，RP多糖對HBsAg、HBeAg的IC50分別為0.710和0.839，TI分別大于14.66和12.39。結果表明RP多糖對HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用為有效低毒。

4討論

作為常用的HBV體外培養(yǎng)細胞模型，HepG2.2.15細胞株可持續(xù)維持病毒復制，穩(wěn)定的分泌HBV病毒及其標志物（HBsAg、HbeAg和HBV-DNA）。本實驗以HepG2.2.15細胞株為細胞模型，通過加藥混合培養(yǎng)，結果表明RP多糖能有效地抑制HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的復制。雖然其抑制效果與拉米夫定有差距（P<0.05），但在來源、成本、毒副作用等方面具有一定的優(yōu)勢，有進一步研究的價值。在臨床感染中，受機體自身免疫功能和病理狀態(tài)的影響，感染細胞HBV-DNA的復制，HBsAg、HBeAg的合成等遠比體外復雜。因此，探討RP多糖抗HBV的有效性及其機制，尚須進行體內實驗及開展更深入的研究。

參考文獻：

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[2]陶慧慧，何云鵬，劉群紅.菲律賓蛤仔藥用價值的研究進展[J].中外健康文摘，2011，8（3）：70-72.

[3]陶慧慧.菲律賓蛤仔多糖的優(yōu)化提取及體外抗HBV作用研究[D].安徽理工大學：研究生處，2011.

[4]Tominaga H，Ishliyama M，Ohseto F，et al.A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell vialility assay[J].Anal Commun，1999，36（1）：47-50.

[5]鄭作文.藤茶總黃酮在2.2.15細胞培養(yǎng)中對乙型肝炎病毒HBsAg、HBeA和HBV-DNA的抑制作用[J].山東中醫(yī)雜志，2003，22（9）：561-563.

[6]何金洋，郭興伯，朱宇同，等.復方肝毒清對乙型肝炎病毒的體內外抑制作用[J].廣州中醫(yī)藥大學學報，2004，21（2）：135.

編輯/申磊