降纖沖劑對(duì)肝纖維化大鼠HA、PCⅢ、及IFN—γ的影響

摘要：目的 探討降纖沖劑對(duì)復(fù)合因素導(dǎo)致的大鼠肝纖維化的防治作用及機(jī)理。方法 采用CCL4合并高脂乳劑及酒精等復(fù)合因素建立大鼠肝纖維化模型，以易善復(fù)為陽(yáng)性對(duì)照，采用光鏡觀(guān)察組織學(xué)改變，檢測(cè)干擾素-γ（IFN-γ）的表達(dá)及血清Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、透明質(zhì)酸（HA）的含量。結(jié)果 降纖沖劑組可減輕肝損傷和纖維化變性程度，降低血清中HA、PCⅢ的含量，提高肝組織中干擾素-γ水平。結(jié)論 降纖沖劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化具有抑制作用。

關(guān)鍵詞：降纖沖劑；肝纖維化；干擾素-γ

隨著我國(guó)人民生活飲食結(jié)構(gòu)的變化以及臨床診斷技術(shù)的不斷提高，各種誘因所致的脂肪肝在我國(guó)的診斷率逐年增加。其肝纖維化的發(fā)生率約高達(dá)25%，且約1.5%～8.0%患者可進(jìn)展為肝硬化[1]，故積極防治脂肪肝對(duì)阻止慢性肝病的進(jìn)展和改善愈后十分重要。目前西醫(yī)尚缺乏理想的針對(duì)性治療藥物。相比而言，中醫(yī)藥具有療效穩(wěn)定、持久、無(wú)副作用、價(jià)廉等優(yōu)勢(shì)，因此深入進(jìn)行中醫(yī)藥治療脂肪肝、預(yù)防肝纖維化的臨床及實(shí)驗(yàn)研究是有其現(xiàn)實(shí)意義的。

脂肪性肝纖維化多由飲酒過(guò)度，或嗜食肥甘厚味，酒食內(nèi)傷，滋生痰濁所致。因濕濁內(nèi)停、痰濁阻滯，形成氣機(jī)郁滯、血脈瘀阻，致氣、血、痰濁互相搏結(jié)、聚滯為積?？傊蝿t應(yīng)以瀉實(shí)為主，予祛痰濁、消積滯。降纖沖劑是在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中摸索創(chuàng)立的經(jīng)驗(yàn)效方，具有祛瘀化濁，消導(dǎo)行滯，疏理解郁之效。本課題旨在通過(guò)降纖沖劑對(duì)肝纖維化大鼠HA、PCⅢ及IFN-γ影響的實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步探討降纖沖劑防治肝纖維化的有效性、可靠性及部分作用機(jī)理。

1資料與方法

1.1雄性Wistar大鼠48只，清潔級(jí)，體重（150±20）g左右。

1.2藥品和主要試劑 降纖沖劑江蘇省鎮(zhèn)江市中醫(yī)院中藥制劑室制備，臨用前用蒸餾水稀釋至所需濃度；易善復(fù)膠囊等。

1.3方法

1.3.1分組 將Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，按體重隨機(jī)分成四組，即：正常對(duì)照組、降纖沖劑組、易善復(fù)組及模型組各12只。

1.3.2造模與實(shí)驗(yàn) 每天上午給模型組、降纖沖劑組、易善復(fù)組每只按1ml/100g體重灌服乳劑（按配方：3號(hào)膽鹽10g，膽固醇40g，豬油80g，吐溫-80 40ml，丙二醇40ml，蔗糖80g，加30°酒精至600ml），正常組灌服等量蒸餾水，并每間隔2d按每只0.2ml/100g體重腹腔注射25% CCL4油液一次，正常組注射同樣生理鹽水。每天下午按1ml/100g體重給降纖沖劑組灌服藥物，按1ml/100g體重給易善復(fù)灌服藥物，模型組和正常組灌服蒸餾水，連續(xù)8w。并于第8w末次給藥后禁食。

1.4觀(guān)察指標(biāo)

1.4.1血清肝纖維化指標(biāo)的測(cè)定 采用放射性免疫實(shí)驗(yàn)方法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求在放射免疫計(jì)數(shù)器上測(cè)定各組大鼠血清透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型膠原（PCⅢ）。

1.4.2肝組織病理學(xué)觀(guān)察 將10%甲醛溶液固定后的肝大葉常規(guī)石蠟切片，HE染色，置顯微鏡下觀(guān)察肝細(xì)胞變性情況，依據(jù)六版內(nèi)科學(xué)教材分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將肝炎病變依炎癥活動(dòng)度及纖維化程度分別分為1～4級(jí)和1～4期，前者又將匯管區(qū)周?chē)装Y（界面炎）與小葉內(nèi)炎癥分為兩項(xiàng)，分別按程度定級(jí)，當(dāng)兩項(xiàng)的程度不一致時(shí)，總的炎癥活動(dòng)度以高者為準(zhǔn)。

1.4.3血清細(xì)胞因子的測(cè)定 將大鼠肝組織石蠟包塊4um連續(xù)切片，采用免疫組化染色法，按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。結(jié)果評(píng)定的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[2]：陽(yáng)性染色者在細(xì)胞漿或（和）細(xì)胞膜呈現(xiàn)淡黃、棕黃、棕褐色顆粒沉著。根據(jù)染色程度及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行分析評(píng)定：基本不著色者為0分，著色淡黃者為1分，棕黃色者為2分，棕褐色者為3分；著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率：5%以下為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%以上為3分。將每張切片染色程度與染色細(xì)胞百分率得分各自相乘，0分為（-）、1～3分為（+）、4～6分為（++）、7～9分為（+++）。

1.5統(tǒng)計(jì)方法 采用PEMS3.1軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用方差分析，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)大鼠一般狀況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中正常對(duì)照組大鼠精神良好，行動(dòng)靈敏，毛發(fā)光澤，飲食、二便正常，體重增加較快。實(shí)驗(yàn)初大鼠注射CCl4表現(xiàn)為煩躁、易激惹。約3w后，所有造模動(dòng)物均趨于平靜、皮毛晦暗無(wú)光澤甚至脫毛、活動(dòng)及飲食減少、糞便稀薄、體重增長(zhǎng)緩慢。與模型對(duì)照組相比，易善復(fù)組與調(diào)脂積組癥狀較輕。

實(shí)驗(yàn)第3w末，由于技術(shù)原因，在灌胃過(guò)程中，降纖沖劑組出現(xiàn)1只死亡大鼠。在第6w末于模型組中隨機(jī)抽取一只大鼠，處死后取肝臟做病理切片，顯示少量纖維細(xì)胞增生，變性明顯，無(wú)壞死，無(wú)假小葉樣結(jié)構(gòu)。于第8w的第3d，再次從模型組中隨機(jī)抽取一只大鼠，處死后取其肝臟做病理切片，顯示肝臟細(xì)胞部分變性壞死，匯管區(qū)纖維細(xì)胞增生，伴少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分中央靜脈偏位，假小葉樣結(jié)構(gòu)形成。提示造模成功。故于第8w末處死全部大鼠。

2.2實(shí)驗(yàn)大鼠肝纖維化指標(biāo)改變，見(jiàn)表1。

2.3肝臟肉眼觀(guān)察和組織病理變化 肉眼觀(guān)察結(jié)果：正常對(duì)照組大鼠肝臟色澤均勻，暗紅，質(zhì)軟，表面光滑，邊緣銳利，肝臟與腹膜之間無(wú)粘連，葉與葉之間分葉清楚；模型對(duì)照組大鼠肝臟體積普遍增大，色澤不均勻，暗黃，質(zhì)韌，表面欠光滑，略呈顆粒狀，邊緣較鈍，肝臟與腹膜之間、肝葉與葉間均有粘連；降纖沖劑組和易善復(fù)組大鼠均可見(jiàn)肝臟色澤均勻，暗紅，體積略增大，表面尚光滑，邊緣略鈍，肝臟與腹膜之間、肝葉之間少量粘連。

光鏡： 正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞無(wú)明顯變性壞死，匯管區(qū)無(wú)擴(kuò)大，未見(jiàn)纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組肝細(xì)胞彌漫變性，以空泡變性和嗜酸性變?yōu)橹?，壞死以小灶性壞死、橋接壞死為主，中央靜脈和匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維間隔及假小葉形成，小葉結(jié)構(gòu)紊亂。降纖沖劑組和易善復(fù)組肝小葉結(jié)構(gòu)尚存，少數(shù)切片可見(jiàn)不完整假小葉形成，多數(shù)未見(jiàn)明顯假小葉結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞變性以少量空泡變性為主，散在小壞死灶，匯管區(qū)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，纖維組織增生不明顯，見(jiàn)表2，表3。

2.4肝組織干擾素-γ水平測(cè)定的比較，見(jiàn)表4。

3討論

肝纖維化是慢性肝病重要的病理特征，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了廣泛深入地研究，認(rèn)識(shí)到它是肝損傷持續(xù)存在時(shí)肝內(nèi)細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)、基質(zhì)-細(xì)胞因子形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)間相互作用的結(jié)果。參與肝纖維化的細(xì)胞外基質(zhì)包括膠原、非膠原糖蛋白和蛋白多糖三大類(lèi)，PCⅢ及HA分別做為膠原、蛋白多糖的代表，對(duì)肝纖維化的診斷意義已得到廣泛認(rèn)可[3，4]。IFN-γ是機(jī)體在免疫應(yīng)答中，由抗原特異性細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生的具有高度生物活性的免疫調(diào)節(jié)因子，是肝纖維化的主要抑制因子。其抗肝纖維化的機(jī)制尚不甚清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為主要通過(guò)以下兩種途徑：①I(mǎi)FN-γ降低成纖維細(xì)胞I、III型前膠原mRNA水平，使膠原合成減少。②IFN-γ抑制HSC的增生和活化，從而減少ECM的合成。原代培養(yǎng)的HSC加入IFN-γ1000 U·L/ml后，其Ⅰ、III型膠原的mRNA水平分別降低3%和24%。在培養(yǎng)激活的星狀細(xì)胞中加入IFN-γ后，細(xì)胞內(nèi)α-SMA mRNA表達(dá)下降，細(xì)胞增殖下降，合成的ECM功能低下[5]。此外IFN-γ還與其他多種細(xì)胞因子相互作用阻止ECM的沉積，有研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ對(duì)促進(jìn)TGF- β的轉(zhuǎn)錄具有拮抗作用[6]?？傊?，IFN-γ是肝纖維化過(guò)程中的重要參與因子，對(duì)纖維化的抑制作用是復(fù)雜的。

本實(shí)驗(yàn)采用CCL4 合并高脂乳劑及酒精等復(fù)合因素建立大鼠肝纖維化模型，該模型在發(fā)病機(jī)制、組織病理學(xué)等方面與目前常見(jiàn)的人脂肪性肝纖維化相似，且較單因素制備的周期短，成模比例高。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，降纖沖劑組肝纖維化大鼠與易善復(fù)組比較各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯差異；與模型組比較，該組大鼠血清中HA、PCⅢ的含量下降，肝組織中IFN-γ水平顯著提高，肝組織中炎癥活動(dòng)度和纖維化程度亦明顯下降。說(shuō)明降纖沖劑有防治肝纖維化的作用，其作用機(jī)制的發(fā)揮是通過(guò)減少細(xì)胞外間質(zhì)中的蛋白多糖和膠原的生成，阻止ECM沉積，減輕肝組織炎癥反應(yīng)，減少纖維增生等多種途徑。本實(shí)驗(yàn)造模同時(shí)即給予藥物預(yù)防，證實(shí)降纖沖劑具有較好的抗肝纖維化作用。在撤除了致病因素后該復(fù)方是否可以促進(jìn)纖維消退、肝小葉重新恢復(fù)、各指標(biāo)恢復(fù)正常，達(dá)到逆轉(zhuǎn)之效，尚有待進(jìn)一步的觀(guān)察和研究。

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編輯/申磊