HLA—A抗原在喉癌鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

摘要：目的 檢測人類白細胞抗原-A抗原（HLA-A）在喉鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義。方法 采用免疫組化SP法和流式細胞術(shù)，觀察20例正常喉組織和58例喉鱗狀細胞癌組織中HLA-A抗原的表達，并結(jié)合患者的臨床病理資料對其結(jié)果進行分析。結(jié)果 ①HLA-A抗原在后鱗狀細胞癌和正常喉組織中的陽性表達率分別為72.4%（42/58），100%（20/20），二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。（P<0.01）。②HLA-A抗原在各級喉鱗狀細胞癌中均有表達，且表達的陽性率隨喉癌分化程度的下降而下降，在不同病理分級之間的陽性率有顯著性差異（P<0.05），且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)（P<0.05）。③喉鱗狀細胞癌組與正常喉組織組HLA-A抗原的平均熒光指數(shù)分別為（x±s）（4.53±0.85）和（8.24±1.30），兩組比較具有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)論 HLA-A抗原可能作為喉鱗狀細胞癌發(fā)生，發(fā)展不同時期的一個標志物，并對判斷喉鱗狀細胞癌的預(yù)后有一定的價值，為臨床診斷治療提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：喉腫瘤癌；鱗狀細胞；HLA-A抗原；免疫組化技術(shù)；流式細胞術(shù)

喉癌是僅次于肺癌的第二大呼吸道高發(fā)癌，目前在我國的發(fā)病率有逐漸走高的趨勢。多種治療方法的綜合應(yīng)用已使患者的生存率和生活質(zhì)量大大提高，但喉癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等問題常使治療效果不佳，術(shù)后頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移仍是患者致死的主要原因[1]。人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA），其編碼基因位于第6號染色體短臂（6p21，31），是一組具有高度多態(tài)性，緊密連鎖的基因群，它分別表達HLA-Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ類抗原分子，HLA-A抗原是經(jīng)典的Ⅰ類抗原之一，具有高度多態(tài)性，廣泛分布于有核細胞的表面，其主要生物學(xué)功能是參與內(nèi)源性抗原的提呈和交叉提呈外源性抗原，激發(fā)特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。

近年來腫瘤免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤的HLA-A抗原表達降低或缺失，致殺傷性T細胞對腫瘤細胞不能識別，腫瘤細胞得以逃避宿主的免疫攻擊，從而不利于腫瘤的臨床治療和T細胞免疫療法的預(yù)后。為進一步研究證實HLA-A抗原的表達情況及其與臨床病理學(xué)及預(yù)后等的相關(guān)性，本組采用免疫組織化學(xué)法染色技術(shù)，檢測了HLA-A抗原在各級鱗狀細胞癌中的表達水平，并對其與臨床病理特征之間的關(guān)系進行了分析，旨在探討此種抗原在喉癌的表達特點及其與臨床病理特征的關(guān)系，為臨床診斷及治療提供一定的理論指導(dǎo)。

1資料與方法

1.1一般資料 58例標本取自沈陽市第一人民醫(yī)院2011年3月～2013年3月，手術(shù)切除并經(jīng)病理證實為喉鱗癌，術(shù)前均未行化療及放射治療，術(shù)后立即將腫瘤組織包埋于OCT組織凍存液中，迅速用液氮處理后，于-80℃凍存，備免疫組化檢測，其中男48例，女10例，年齡38～76歲，中位年齡60歲；依照國際抗癌協(xié)會TNM分期標準分期，Ⅰ-Ⅱ期23例，Ⅲ-Ⅳ期35例；聲門上型25例，聲門型33例，組織病理學(xué)分級，高分化32例，中分化15例，低分化11例；其中15例有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)后經(jīng)病理檢測得到證實。同時取20例喉部正常組織做對照（對照組取自喉全切除術(shù)，均經(jīng)病理證實為正常喉組織）。另取喉鱗狀細胞組織及正常喉組織標本各8例，備流式細胞檢查。

1.2結(jié)果判定

1.2.1免疫組化的結(jié)果判定標準 HLA-A抗原陽性主要表達在細胞膜，呈棕褐色或棕黃色，胞漿亦有淡染。按Mattern等提出的標準，從兩方面進行半定量評分：①按染色細胞的百分比評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞<25%為1，陽性細胞25%～50%為2分，陽性細胞>50%為3分。②按染色細胞強度評分：無顯色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。③將這兩方面評分相加計總分（0～6分），>2分為陽性表達，≤2分為陰性表達。

1.2.2 HLA-A染色灰度的測定 利用IBASⅡ圖像分析系統(tǒng)，檢測免疫組化染色陽性的各組標本中的HLA-A抗原的相對含量，每組檢測5張切片。被測樣品先光學(xué)顯微鏡成像，隨機選5個測量視野，由電視機攝像后，被測細胞呈像余彩色監(jiān)視器上，并輸入計算機處理，計算被測細胞的灰度值?；叶戎捣秶鸀?～255，其中0代表灰度最深，255代表灰度最淺。

1.2.3流式細胞術(shù)結(jié)果觀察 按照Morkve等提出的熒光指數(shù)（fluorescence index，F(xiàn)I）表示HLA-A抗原表達的相對含量。公式如下：FI=瘤細胞表達的平均熒光強度/正常對照樣品平均熒光強度。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 運用統(tǒng)計軟件SPSS11.5進行t檢驗，χ2檢驗，F(xiàn)isher精確計算。

2結(jié)果

2.1免疫組化結(jié)果

2.1.1 HLA-A抗原在喉鱗狀細胞癌和正常喉組織中的表達情況 在喉癌組和對照組中HLA-A抗原陽性表達率分別為72.4%（42/58），100%（20/20），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，HLA-A 抗原在喉癌組和對照組中的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖1。

2.1.2 HLA-A抗原的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 對58例LSCC組織中HLA-A抗原的表達與臨床病理參數(shù)進行研究，發(fā)現(xiàn)Ⅰ～Ⅱ期LSCC組織中HLA-A抗原陽性率86.9%（20/23）較Ⅲ～Ⅳ62.8%（22/35）高，兩組比較有顯著性差異（P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者其陽性率46.7%（7/15）較為轉(zhuǎn)移者81.4%（35/43）低，兩組比較有顯著性差異（P<0.05）；在高，中，低分化LSCC組織中HLA-A抗原陽性率分別為93.8%（30/32），66.7%（10/15），18.2%（2/11），組間比較均有顯著性差異（P<0.05），可見HLA-A抗原的表達與TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤分化程度密切相關(guān)，且隨腫瘤分化程度的降低，HLA-A抗原的表達減少。此外，HLA-A抗原的表達與年齡，性別，原發(fā)部位無關(guān)（P>0.05），見表1。

2.2 HLA-A抗原陽性表達強度與喉鱗癌分化程度的關(guān)系 在陽性表達的喉鱗癌組織中，高分化LSCC陽性細胞多而染色深，呈片狀分布，見圖2；中分化LSCC陽性細胞較高分化者少，染色較淺，局灶性分布，見圖3；低分化LSCC陽性細胞較少，染色淺，彌散性分布，見圖4；圖像分析表明，從高分化鱗癌，中分化鱗癌到低分化鱗癌，代表HLA-A抗原染色強度的灰度值增加，即染色逐漸降低（灰度值和染色強度呈反比），各組間均有顯著性差異（P<0.05），見表2，其結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。

2.3流式細胞儀檢測HLA-A抗原表達的相對含量 用流式細胞儀檢測LSCC組與正常喉組織組中HLA-A抗原表達的相對含量，LSCC組與正常喉組織組的平均FI分別為（x±s）（4.53±0.85）和（8.24±1.30），t檢驗顯示兩組間定量表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表3。

3討論

HLA-A類抗原是人體細胞重要的表面抗原之一，在機體免疫應(yīng)答及調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用。近年來研究表明HLAⅠ類抗原分子出現(xiàn)異常，即可使腫瘤逃逸機體的免疫殺傷，而使腫瘤得以發(fā)展，因此HLAⅠ類抗原在介導(dǎo)腫瘤的免疫排斥中具有重要作用，而作為其經(jīng)典抗原之一的HLA-A抗原，作用不可忽視。

腫瘤細胞有多種逃避免疫細胞識別的機制，調(diào)整細胞表面HLA-A抗原的表達是最常見的一種，一般認為表達下降或缺如是細胞惡性轉(zhuǎn)化的早起事件或相關(guān)環(huán)節(jié)之一[2]。HLA-A抗原提呈內(nèi)源性抗原肽給細胞毒性CD8+T細胞，CD8+T細胞是中立的主要效應(yīng)細胞，它的激活是通過TCR識別HLA-A抗原及其提呈的內(nèi)源性抗原肽所構(gòu)成的復(fù)合體來進行的。高親和力的復(fù)合體將延長抗原肽提呈給免疫細胞的時間，更有利于細胞毒T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞。在人類多種腫瘤中，HLA-A抗原表達的降低和缺失被認為是腫瘤免疫逃避T細胞殺傷的一種方式并有助于腫瘤演進[3]。

1976年人們首次描述了鼠淋巴瘤相關(guān)MHC抗原的缺失，1977年首次對人類腫瘤中HLA缺失進行檢測，研究至今人們發(fā)現(xiàn)越來越多的腫瘤存在HLA抗原的缺失，如乳腺癌，結(jié)腸癌，卵巢上皮癌等，來源于上皮組織的腫瘤中39%～88%伴有HLA缺失。在喉癌組織的最初研究中，Cabrera[4]等檢測76例喉癌，發(fā)現(xiàn)66%存在HLAⅠ抗原的改變，13.15%的HLA-A缺失，但HLA-A缺失與喉癌發(fā)生，發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚未見報道。為了闡明其功能，研究者們進一步作了大量實驗。后來Eura等研究發(fā)現(xiàn)喉癌組織中的HLA-A等位基因出現(xiàn)頻率明顯下降，與腫瘤細胞惡變相關(guān)。在本次研究中，我們采用免疫組化法及流式細胞檢測技術(shù)，檢測了HLA-A抗原在喉鱗狀細胞癌的表達，并設(shè)正常喉組織為對照組，比較喉癌和正常喉組織中HLA-A抗原的差異。結(jié)果顯示，HLA-A抗原在喉癌中的表達水平低于其對照組，差異有顯著性（P<0.01）。這一結(jié)果與上述文獻報道相似，提示HLA-A抗原在喉癌的發(fā)生，發(fā)展中具有一定的作用，但我們檢測到有27.6%喉癌標本HLA-A缺失，顯著高于上述文獻報告結(jié)果，這可能是由于不同人類組織間的差異所致。

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤，許多因素影響治療效果和預(yù)后，病理分級和臨床分期是其中之一。在研究中我們發(fā)現(xiàn)，HLA-A抗原在不同病理分級的鱗狀細胞癌中均有表達，根據(jù)灰度值分析，高分化鱗癌明顯高于中分化鱗癌（P<0.05），中分化鱗癌又明顯高于低分化鱗癌（P<0.05），各組間差異顯著。說明隨著鱗癌分化程度的降低，其細胞表面的HLA-A抗原表達也隨之降低，HLA-A抗原缺失與腫瘤細胞惡性程度呈正相關(guān)。在臨床分期中，晚期鱗癌（Ⅲ/Ⅳ期）HLA-A抗原的表達顯著低于早期鱗癌（Ⅰ/Ⅱ期）。因此我們認為，免疫組化法檢測HLA-A抗原的表達為頭頸部鱗狀細胞癌提供了一個獨立的預(yù)測因子，它可以預(yù)測患者高危險性的發(fā)生。在我們實驗中，喉癌患者HLA-A抗原的表達水平與年齡，性別及原發(fā)部位無關(guān)，但其表達減少與病理分級和臨床分期顯著相關(guān)，提示HLA-A抗原的表達與喉癌的惡性進展有關(guān)。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時喉鱗癌預(yù)后不良的重要指標，本實驗中HLA-A抗原表達陽性的病例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為46.7%（7/15），表達陰性的病例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為81.4%（35/43），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗有顯著性差異（P<0.05）。因此HLA-A抗原可作為判斷喉癌患者預(yù)后的標志之一。

了解HLA異常的分類及原因，對腫瘤的治療具有重要的指導(dǎo)意義。Algarra等把腫瘤細胞上HLA異常的表型分為5類：①整個HLA缺失，一般是由于β2微球蛋白異常或HLA分子裝配和穩(wěn)定性的缺陷。②HLA單倍體缺失，可能是染色體不分離或有絲分裂重組時造成。③HLA基因座位缺失，通常由于轉(zhuǎn)錄水平受到影響。④HLA等位基因丟失，通常是基因點突變，HLA基因部分缺失或者染色體斷裂及突變引起。⑤混合型，不同于單獨的某一種缺失，往往只保留一個HLA等位基因。而在LSCC中，HLA-A抗原表達缺失的類型及原因看尚不完全清楚，還需做進一步的研究。深入研究腫瘤細胞中HLA-A抗原的改變，將為HLA-A抗原在腫瘤免疫逃避中的作用提供更為確切的信息，為臨床上腫瘤預(yù)后的監(jiān)測，疫苗的制備提供確鑿依據(jù)。

參考文獻：

[1]D′Cruz AK，Sharma S，Pai PS.Current status of near-total laryngectomy ：review[J].J Laryngol Otol，2012，126（6）：556-562.

[2]Aspord C，Leceia MT，Salameive D.HLA-A（*）0201（+）plasmacytoid dendritic cells provide a cell-based immunotherapy for melanoma patients.[J].J Invest Dermatol，2012，132（10）：2395-2406.

[3]Hanagiri T，Shigematsn Y，Shinohara S.Clinical significance of expression of cancer/testies antigen and down-reglation of HLA class-Ⅰin patients with stage Ⅰnon-small cell lung cancer.[J].Anticancer Res.201333（5）：2123-2128.

[4]Garrido F，Cabrea T，Aptsiauri N.\"Hard\"and\"soft\"lesions underlying the HLA classⅠalterations in cancer cells implications for immunotherapy.[J].Int J Cancer，2010，127（2）：249-256.

編輯/肖慧