摘要:目的 觀察淫羊藿對(duì)LARS韌帶周?chē)晒羌?xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性影響。方法 將Wistar乳鼠顱骨原代分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞接種于nHA、LARS韌帶及nHA介導(dǎo)的LARS韌帶的表面,同時(shí)用淫羊藿去干預(yù),21d時(shí)檢測(cè)ALP活性。結(jié)果 nHA表面上ALP活性最高,LARS韌帶表面ALP活性最低,LARS韌帶介導(dǎo)的nHA表面上ALP活性略高于空白組,但無(wú)顯著性差異,但當(dāng)淫羊藿干預(yù)后有了顯著性差異。結(jié)論 淫羊藿結(jié)合nHA能明顯增加LARS韌帶周?chē)鶤LP的活性,促進(jìn)成骨細(xì)胞的功能及代謝活動(dòng)。
關(guān)鍵詞:LARS韌帶; 納米羥基磷灰石;堿性磷酸酶;淫羊藿
1 資料與方法
1.1淫羊藿提取液淫 羊藿生藥購(gòu)自同仁堂集團(tuán)公司。淫羊藿提取液按高子范等[1]的方法制備,提取液相當(dāng)于1.5g/ml生藥。
1.2納米羥基磷灰石制備:①取Ca(NO3)2·4H2O78.7g,加300 ml去離子水配制溶液,加10ml30% 氨水,將pH值調(diào)至11~12,稀釋到600ml。②取(NH4)2HPO4 26.4g ,用500m去離子水配成溶液,加30%氨水250 ml,將pH調(diào)值至11~12,再稀釋至1067ml,將沉淀物溶解,測(cè)pH值,加30%氨水,使其pH值保持在11~12。③在25℃條件下,將(NH4)2HPO4加至Ca(NO3)2溶液中,同時(shí)劇烈攪拌20min,加完后再繼續(xù)劇烈攪拌24h。④抽濾反應(yīng)物,無(wú)水乙醇洗滌3次,在90℃條件下干燥15h。⑤把干燥樣品放入高溫爐中煅燒,在1100℃保溫1h,再冷卻至室溫,得到HA粉體。將HA粉體制備成直徑10mm、厚2 mm 的圓片型,從室溫至1200℃的條件下燒1h,得到納米HA(nHA) 。
1.3 骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 新生24h以內(nèi)的Wistar大鼠乳鼠,用75%乙醇浸泡5min。取出顱骨,去凈表面的骨膜及軟組織, 再浸入DMEM 培養(yǎng)液中, 沖洗2次。在培養(yǎng)皿中剪碎為0.5mm×0.5mm碎片。加0. 25%Ⅰ型膠原酶1ml和PET液5 ml,在孵箱中消化20min,反復(fù)吹打,棄上清液,此操作反復(fù)3次,取第3次消化后的上清液,于4℃離心5min(1000 r/min),至細(xì)胞沉淀。棄上清液,入完全培養(yǎng)液懸起細(xì)胞沉淀, 并洗細(xì)胞2 次,臺(tái)盼蘭染色顯示90%以上細(xì)胞存活。將細(xì)胞懸液于25 ml培養(yǎng)瓶中,密度為5. 0× 104 / ml,于37℃飽和濕度, 5%CO2 的孵箱中培養(yǎng)。24h后換液,以后隔日要換液1次。將傳到第3代的成骨細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化脫壁, 制成懸液, 4℃離心收集細(xì)胞,用于接種在實(shí)驗(yàn)中各組材料上。
1.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為6組, 即LARS韌帶組、LARS韌帶加淫羊藿組、nHA 組、內(nèi)放nHALARS韌帶(nHA-LARS)組、nHA-LARS加淫羊藿組及空白組,其中空白組為Φ10mm圓形載玻片。
1.5 細(xì)胞接種 在96孔培養(yǎng)板中分別放LARS韌帶組、LARS韌帶加淫羊藿、nHA 、nHA-LARS、nHA-LARS加淫羊藿以及空白組的圓形載玻片,其中淫羊藿濃度20mg/L,每組4 孔,將傳代第3 代的成骨細(xì)胞接種至材料的表面( 密度1.5×104/ ml ),靜置片刻后緩慢加入完全培養(yǎng)液1 ml,密閉后置于37℃飽和濕度, 5%CO2 的孵箱中密閉培養(yǎng)7d。
1.6 細(xì)胞裂解液制備 成骨細(xì)胞接種后第21d將培養(yǎng)板各孔內(nèi)上清液吸出, PBS 洗去未附著的細(xì)胞, 用蒸餾水洗3 次,三次凍融培養(yǎng)的細(xì)胞, 吸管反復(fù)吹打各孔中細(xì)胞1 min,從而制成不同組份的細(xì)胞裂解液。
1.7 堿性磷酸酶活性的測(cè)定 以上每組10只試管,各試管加100μl上述細(xì)胞裂解液, 細(xì)胞裂解液與ALP檢測(cè)試劑盒內(nèi)500μl反應(yīng)液混合之后,37℃恒溫下反應(yīng)30 min,變成黃色后加入0.25N NaOH1.5ml終止反應(yīng)。用MR600紫外光分光光度計(jì)于400nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的光吸收值。以蒸餾水為空白對(duì)照、以對(duì)硝基苯酚為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算各實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶含量(nmolp-nitrophenol/min/mg·pro 表示)。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,計(jì)算各組數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差,方差分析比較各組間差異,以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
nHA表面上ALP活性最高,LARS韌帶表面ALP活性最低,nHA介導(dǎo)的LARS韌帶表面上ALP活性略高于空白組,但無(wú)顯著性差異,但當(dāng)淫羊藿干預(yù)后有了顯著性差異( P<0.05)(見(jiàn)表1)。
3討論
近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿具有促進(jìn)骨骼生長(zhǎng),阻止鈣質(zhì)流失,預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用[2]。納米羥基磷灰石由于表面效應(yīng)使其表面原子存在許多懸空鍵,有很高的化學(xué)活性,可增加材料生物活性和成骨誘導(dǎo)的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,淫羊藿結(jié)合納米羥基磷灰石能明顯增加LARS韌帶周?chē)鶤LP的活性,促進(jìn)成骨細(xì)胞的功能及代謝活動(dòng),為臨床促進(jìn)LARS韌帶在骨隧道內(nèi)與骨愈合的研究提供了一種思路。
參考文獻(xiàn):
[1] 高子范,揚(yáng)宗智,馬克昌,等.淫羊藿提取液對(duì)試管內(nèi)雞胚股骨生長(zhǎng)的促進(jìn)作用[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志, 1985, 5: 172 - 173.
[2] 殷曉雪,陳仲?gòu)?qiáng),黨耕町,等.淫羊藿苷對(duì)人成骨細(xì)胞增殖與分化的影響[J].中國(guó)中藥雜志, 2005, 30: 289- 291.
編輯/王海靜