高效液相色譜法同時測定大鼠體內和厚樸酚與厚樸酚

摘要：目的 建立高效液相色譜法（HPLC）同時測定大鼠血漿中和厚樸酚與厚樸酚的方法，以測定大鼠直腸給藥（厚樸提取液）后和厚樸酚與厚樸酚的血藥濃度-時間曲線。方法 采用Hanbon Hedera ODS-2色譜柱，流動相：甲醇-水-磷酸（83：17：0.1），流速：0.5 mL/min，檢測波長：290 nm，柱溫：35 ℃；0.1 mL血漿加入2倍量含內標的乙腈溶液沉淀蛋白，再加入氯化鈉分離水層，取上層有機相進樣分析。結果 和厚樸酚與厚樸酚的檢測限分別為15和30 ng/mL，和厚樸酚在20～200 ng/mL、厚樸酚在40～400 ng/mL范圍內線性關系良好，提取回收率均大于92%，RSD均小于15%。結論 本方法簡便、準確，可用于大鼠血漿中和厚樸酚與厚樸酚濃度的測定。

關鍵詞：HPLC；和厚樸酚；厚樸酚

厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd. et Wils. 或凹葉厚樸M. officinalis Rehd. et Wils.var. biloba Reht et Wils.的干燥根皮、枝皮及干皮[1]。主要化學成分為和厚樸酚、厚樸酚等木脂體類化合物，藥理作用明顯，臨床應用廣泛。其主要成分體內過程研究不多，文獻報道的同時測定大鼠服用厚樸類成分后血漿中和厚樸酚與厚樸酚的方法前處理較繁瑣或色譜條件較復雜，本文旨在建議一種簡便、準確的測定方法，為其體內過程研究提供幫助[2～4]。見圖1。

1材料與儀器

和厚樸酚、厚樸酚對照品（批號分別為110730-201313、110729-200412，購自中國藥品生物制品檢定研究院）；內標聯苯（購自Sigma公司） ；厚樸（購自山東省醫(yī)藥公司，經鑒定為Magnolia officinalis Rehd. et Wils）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；水為純化水，其他為分析純。高效液相色譜儀（Agilent 1100，美國安捷倫）；旋渦混合儀（上海醫(yī)科大學儀器公司）；臺式離心機（上海醫(yī)療器械有限公司）；電子天平（Sartorius BP 211D，德國賽多利斯）。Wistar大鼠，雄，8周齡，280～320 g （山東大學實驗動物中心）。

2方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：Hanbon Hedera ODS-2（4.6×150mm，5 m，江蘇漢邦科技有限公司）；柱溫：35℃；流動相：甲醇-二氯甲烷-水-磷酸（81：3：16：0.1）；流速：0.5mL/min；檢測波長：590nm；進樣量：20μL[5]。

2.2血樣采集與樣品預處理 試驗前大鼠禁食12 h，不禁水，乙醚麻醉后埋置股動脈留置針。至少蘇醒1h后直腸給藥（厚樸用40%乙醇提取，每只大鼠按 245mg/kg，相當于13.5、24.4mg/kg的和厚樸酚與厚樸酚給藥，共6只大鼠）。采集0min和給藥后10，20，30，45，60，90，120，180，240和360 min的全血各0.25 mL，置肝素化塑料離心管中，離心分離得血漿樣品。

取0.1mL血漿樣品，加入0.2 mL乙腈渦旋5 min沉淀蛋白，15600 r/min離心5 min，取上清置另一1.5mL塑料離心管中，加入氯化鈉60mg，混勻后靜置10 min，于15600 r/min離心5min，取上層有機相20μL進樣，進行高效液相色譜分析。

2.3方法學驗證

2.3.1專屬性 本試驗所采用的色譜條件下，和厚樸酚保留時間為6.2 min左右，厚樸酚保留時間為8.2 min左右；內標（聯苯）的保留時間為10.1 min左右。見圖2，待測成分和內標峰形良好，無雜峰干擾測定。

2.3.2線性范圍和最低定量限 精密稱取和厚樸酚與厚樸酚對照品適量，以甲醇-水（6：4）溶解，制備標準儲備液；取0.1 mL大鼠空白血漿若干份，加入上述標準儲備液適量，制成含和厚樸酚為20、40、60、80、100、150、200ng/ml，厚樸酚為40、60、80、100、150、250、400ng/ml的含藥血漿。按\"2.3.1\"的方法處理后進行HPLC分析，記錄色譜圖，計算待測成分的峰面積與內標峰面積的比值f。以峰面積比值f分別對待測成分的血藥濃度C作權重回歸計算。得典型回歸方程（和厚樸酚：f =0.0021×C-0.0186，r2=0.9968；厚樸酚：f = 0.0022 ×C-0.0253，r2=0.9960）。此條件下，和厚樸酚與厚樸酚的檢測限分別為15和30 ng/mL。

2.3.3精密度和提取回收率 取大鼠空白血漿若干，制備含和厚樸酚和厚樸酚濃度分別為50、100、180，50、200、350 ng/ml的含藥血漿樣品，按\"2.2\"操作，共做3批，每個濃度各配制5份。制備空白血漿提取液若干，加標準儲備液適量，配成和厚樸酚和厚樸酚濃度分別為50、100、180，50、200、350 ng/mL的提取回收率對照品，取一批精密度樣品作為提取回收率樣品，按\"2.1\"條件測定。結果表明：待測成分的批內和批間樣品的RSD均小于15%，精密度符合要求，提取回收率均大于92%，見表1。

2.4應用 按\"2.1\"和\"2.2\"的方法操作，測定給藥后采集的大鼠血漿樣品，得血藥濃度-時間曲線見圖3。

參考文獻：

[1]中國藥典.一部[S].2010：235.

[2]孟超，吳豐，馬林.厚樸類中藥厚樸酚及和厚樸酚含量測定[J].天然產物研究與開發(fā)，2007，19：1024-1026.

[3]王曉園，白小紅，張紅芬，等.液相微萃取-非水后萃取-高效液相色譜法測定大鼠體內厚樸酚與和厚樸酚的濃度[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2008，28（10）：780-784.

[4]袁成，梁愛君，曾林，等.厚樸酚與和厚樸酚在大鼠體內的藥代動力學[J].解放軍藥學學報，19（4）：258-261.

[5]趙陸華.高效液相色譜法分析中藥成分手冊[M].北京：中國科技醫(yī)藥出版社，1994，443.

編輯/許言