梔子不同部位中活性成分的含量測(cè)定

摘要：目的 對(duì)生藥梔子中幾種活性成分進(jìn)行定性定量分析，并對(duì)不同產(chǎn)地、不同部位中所含成分進(jìn)行探討。方法 采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)梔子水提取液進(jìn)行活性成分測(cè)定。結(jié)果 中國(guó)產(chǎn)與日本產(chǎn)梔子中確定了京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷2種成分。不同產(chǎn)地梔子中主要成分含量稍有區(qū)別，但梔子果皮，種子等不同部位中主要成分含量與分布不同。結(jié)論 HPLC-MS/MS法可準(zhǔn)確、快速、同時(shí)測(cè)定梔子中多種成分，對(duì)生藥梔子的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：梔子；HPLC-MS/MS；京尼平苷；京尼平龍膽二糖苷

梔子（Gardenia jasminoides Ellis）：別名黃梔子、山梔、白蟾，是茜草科植物梔子的果實(shí)[1]，常用于蒙藥、中藥及日本漢方。蒙藥藥效：梔子蒙語(yǔ)名\"朱如拉\"，蒙藥希拉湯和森登四味湯散的主要成分。具有清血熱、明目、祛\"巴達(dá)干協(xié)日\(chéng)"、生津、調(diào)元之功效[2]。中藥藥效：梔子的果實(shí)是傳統(tǒng)中藥，屬衛(wèi)生部頒布的第l批藥食兩用資源，具有護(hù)肝、利膽、降壓、鎮(zhèn)靜、止血、消腫等作用[1]。日本漢方藥效：利膽、鎮(zhèn)靜、止血、解熱為目的，用于精神不安、充血、黃疸等病狀[3]。其化學(xué)成分主要含環(huán)烯醚萜類成分，如京尼平苷（geniposide）、京尼平龍膽二糖苷（genipingentiobioside）、羥異梔子苷（gardenoside）、京尼平苷酸（geniposidic acid）等[4]。筆者用HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定梔子中的活性成分，對(duì)其京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷2種成分進(jìn)行了定性定量分析，結(jié)果已另文報(bào)道。本文對(duì)中國(guó)產(chǎn)和日本產(chǎn)梔子的成分含量進(jìn)行對(duì)比，并對(duì)梔子的果皮、種子所含成分進(jìn)行了分析。

1資料與方法

1.1儀器 高效液相色譜儀Prominence LC-20A（日本SHIMADZU）；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀API2000 LC/MS/MS三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)AB SCIEX）；數(shù)控式超聲波細(xì)胞粉碎器，SONOPULS UW2070，BANDELIN。

1.2試劑 色譜純甲醇，（日本W(wǎng)ako）；蒸餾水，HPLC用蒸餾水；對(duì)照品：京尼平苷，（日本W(wǎng)ako，批號(hào)00007070-212）；京尼平龍膽二糖苷，（四川省維克奇生物科技，批號(hào)130527）；梔子（購(gòu)于內(nèi)蒙古中山路藥店和日本樋口藥店）

1.3方法

1.3.1對(duì)照品溶液制備 [對(duì)照品]對(duì)照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷分別配置1mg·ml-1的水溶液和1：1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，使用前再稀釋100倍。

1.3.2供試品溶液制備 生藥梔子研細(xì)，過(guò)60目篩，精密稱取粉末0.5g，加超純水10ml，超聲 （70W、20kHz） 提取30min，高速離心機(jī)離心（3000rpm）20min，上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，既得。HPLC測(cè)定時(shí)再稀釋1000倍后使用。

1.3.3色譜、質(zhì)譜條件 [色譜條件] 色譜柱：ACE C8（100mm×2.1mm， 5μm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-水溶液（梯度洗脫）；流速：0.2 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：0.5μl。

[質(zhì)譜條件] 電離源：電噴霧離子源；掃描模式：正離子檢測(cè)；掃描范圍：10～1100（m/z）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用AB SCIEX公司Analyst 1.4.2軟件處理。

1.4方法學(xué)考察

1.4.1線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的溶液，用超純水配制分別為0.1、1、5、50、100 mg·ml-1等不同濃度的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行進(jìn)樣測(cè)定3次。以對(duì)照品濃度X（mg·ml-1）為橫坐標(biāo)，以色譜峰峰面積Y為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的直線回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r）分別為：

y=22863x-1045.2 r=1.000 00

y=18471x-3431.9 r=0.999 98

京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷均在0.1～100 mg·ml-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，分析方法學(xué)效能指標(biāo)滿足定量分析方法驗(yàn)證要求。

1.4.2加標(biāo)回收率 精密吸取供試品溶液，分別添加低、中、高3個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣0.5μl進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)添加水平測(cè)定5次，計(jì)算京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的平均加樣回收率，見(jiàn)表1。

2結(jié)果

2.1對(duì)照品測(cè)定 取對(duì)照品溶液各0.5 μl注入高效液相色譜儀中，進(jìn)行HPLC-MS測(cè)定。對(duì)照品的色譜圖中京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的保留時(shí)間分別為15.23 min和14.16 min（圖1A、B），質(zhì)量電荷比分別為410.8 m/z，amu和572.9 m/z，amu（圖1C、D）。對(duì)照品的準(zhǔn)離子峰進(jìn)行MS/MS測(cè)定，二級(jí)質(zhì)譜碎片離子中分別測(cè)得質(zhì)荷比22.8±0.5 m/z，amu的離子，推斷為Na離子。從而確定，所測(cè)得中京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的質(zhì)量電荷比為母離子加合鈉離子形式出現(xiàn)（M+Na）。

2.2供試品測(cè)定

2.2.1不同產(chǎn)地梔子含量測(cè)定 HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地梔子（中國(guó)產(chǎn)，日本產(chǎn)）水提取液，色譜圖中不同產(chǎn)地梔子的三個(gè)峰的保留時(shí)間一致。其中峰1和峰2與對(duì)照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的保留時(shí)間完全吻合。分別精密吸取供試品溶液和混合對(duì)照品溶液各10μl，注入HPLC儀，測(cè)定色譜峰峰面積，外標(biāo)一點(diǎn)法（外標(biāo)法）計(jì)算含量，見(jiàn)表2。

由表2可知，中國(guó)產(chǎn)和日本產(chǎn)梔子中京尼平苷平均含量相當(dāng)，中國(guó)產(chǎn)梔子中京尼平龍膽二糖苷平均含量比日本產(chǎn)略高。

2.2.2梔子不同部位含量對(duì)比 梔子果實(shí)剝皮，分別將梔子果實(shí)、果皮和種子按照\(chéng)"2.2\"項(xiàng)分別制備供試品溶液，進(jìn)行HPLC測(cè)定。色譜圖中梔子（日本產(chǎn)）的不同部位的色譜峰有所不同（圖2）。與梔子果實(shí)水提取液色譜圖（圖2A）比較，果皮水提取液無(wú)保留時(shí)間為14.17 min的峰（圖2B），種子水提取液無(wú)保留時(shí)間為11.70 min的峰（圖2C）。其中峰1和峰2與對(duì)照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的保留時(shí)間完全吻合。用HPLC儀測(cè)定色譜峰峰面積，外標(biāo)法計(jì)算含量，見(jiàn)表3。

由表3可知，梔子果皮中京尼平苷平均含量不到果實(shí)的一半，幾乎不含京尼平龍膽二糖苷，但峰3的含量明顯高于果實(shí)和種子。梔子種子中京尼平苷平均含量為果皮的3倍多，京尼平龍膽二糖苷含量比果實(shí)多0.5倍，HPLC未測(cè)得峰3。

3結(jié)論

梔子主要產(chǎn)于中國(guó)、韓國(guó)、日本，用于中藥、蒙藥和日本漢方。中國(guó)產(chǎn)梔子形狀長(zhǎng)卵形、而日本產(chǎn)梔子相對(duì)短粗，但水提取液總離子流圖基本一致，主要成分含量稍有區(qū)別。目前梔子的質(zhì)量控制是以環(huán)烯醚萜類成分梔子苷含量的高低進(jìn)行評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中國(guó)產(chǎn)和日本產(chǎn)梔子藥材樣品中京尼平苷（梔子苷）的含量均符合《中國(guó)藥典》不得低于1.8%的規(guī)定[1]。

本實(shí)驗(yàn)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)確定了生藥梔子中京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷等2種成分，并對(duì)不同產(chǎn)地梔子及其不同部位中的成分含量進(jìn)行了測(cè)定。該方法準(zhǔn)確、快速、能夠同時(shí)測(cè)定梔子中幾種成分，可作為生藥梔子的質(zhì)量控制的有效方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：231-232.

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)[S].蒙藥分冊(cè)，1998，2.

[3]原島廣至.生藥單[S].NTS，2007：124-125.

[4]顏升，董艷凱，陳健，等.中藥梔子的研究現(xiàn)狀[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（18）： 7759-7760，7772.

編輯/申磊