238散發(fā)性結(jié)直腸癌錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)分析及其臨床意義

摘要：目的 分析錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)規(guī)律及臨床意義。方法 選取2009年1月～2013年10月經(jīng)病理學(xué)確診的散發(fā)性結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本238例，所有患者在術(shù)前均未接受過(guò)放療或化療。免疫組織化學(xué)（Envision法）檢測(cè)MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 散發(fā)性結(jié)直腸癌組織中錯(cuò)配修復(fù)蛋白的缺失率16.8%（40/238），與腫瘤的分化、發(fā)病年齡、性別方面均無(wú)相關(guān)性（r值均在-0.1～0.1）。MSH2與MSH6蛋白缺失有相關(guān)性（r=0.71），MLH1和PMS2蛋白的缺失率有相關(guān)性（r=0.70），MLH1與MSH2、MSH6蛋白缺失無(wú)相關(guān)性（r=-0.03、r=-0.01），PMS2與MSH2、MSH6蛋白缺失無(wú)相關(guān)性（r=-0.008、r=-0.02）。錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失組與無(wú)缺失組在腫瘤的分化、發(fā)病年齡、性別方面均無(wú)差異性（P>0.05）。結(jié)論 在散發(fā)性結(jié)直腸癌組織中錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2缺失與腫瘤的分化、發(fā)病年齡、性別方面均無(wú)相關(guān)性。MSH2與MSH6蛋白缺失有相關(guān)性，MLH1和PMS2蛋白的缺失率有相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：散發(fā)性結(jié)直腸癌；錯(cuò)配修復(fù)蛋白；免疫組織化學(xué)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。其發(fā)生發(fā)展涉及到一系列遺傳學(xué)改變。已有大量的研究證實(shí)，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）存在于遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（HNPCC），部分散發(fā)性結(jié)直腸癌（SCRC）胃癌等當(dāng)中，MSI是錯(cuò)配修復(fù)基因的異常造成的。錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)是遺傳不穩(wěn)定性的守護(hù)者，具有識(shí)別和修復(fù)DNA合成期間的錯(cuò)配堿基的功能[1]。通常由錯(cuò)配修復(fù)基因 MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2 編碼的錯(cuò)配修復(fù)蛋白修正這類錯(cuò)誤[2]。有研究報(bào)道，細(xì)胞系中錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺陷與化療劑的抵制有相關(guān)性。MSI陽(yáng)性腫瘤的預(yù)后和化療敏感性與MSI陰性病例不同，通過(guò)檢測(cè)表型為治療和預(yù)后提供依據(jù)[3]。

1資料與方法

1.1一般資料 選取2009年1月～2013年10月經(jīng)病理學(xué)確診的散發(fā)性結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本238例，所有患者在術(shù)前均未接受過(guò)放療或化療。其中男性125例，女性113例；年齡26～85歲，平均年齡（64.7±12.0）歲，中位年齡66歲；高分化腺癌7例，中分化腺癌197例，低分化腺癌34例。

1.2方法 鼠抗人MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2的單克隆抗體及免疫組織化學(xué)染色Envision法試劑盒為Dako公司產(chǎn)品。購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，貼于經(jīng)APES處理的載玻片上，分別進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。用已知陽(yáng)性標(biāo)本切片做陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.3結(jié)果判定 每張切片選擇有代表性的區(qū)域，并避開(kāi)切片周邊區(qū)域，光鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野。參照Friedrichs等[4]免疫組化評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，染色深淺需與背景染色相對(duì)比，分別對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分。染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)色為 0 分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。0分與<20%腫瘤細(xì)胞1 分為低表達(dá)，陰性。四個(gè)錯(cuò)配修復(fù)蛋白任何一個(gè)缺失為MSI陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析均采用SPSS16.0軟件，錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失與腫瘤的相關(guān)性及MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2之間的相關(guān)性分析采用PEARSON相關(guān)分析，絕對(duì)值在0.8～1.0極強(qiáng)相關(guān)，0.6～0.8強(qiáng)相關(guān)，0.4～0.6中等程度相關(guān)，0.2～0.4弱相關(guān)，0.0～0.2極弱相關(guān)或無(wú)相關(guān)。

2結(jié)果

2.1散發(fā)性結(jié)直腸癌組織中錯(cuò)配修復(fù)蛋白的缺失率為16.8%（40/238），與腫瘤的分化、發(fā)病年齡、性別方面均無(wú)相關(guān)性（r值均在-0.1～0.1）。在Envision法做的免疫組化染色中，MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白主要在上皮細(xì)胞核中表達(dá)，部分胞質(zhì)僅有弱陽(yáng)性，不作為陽(yáng)性判斷，間質(zhì)細(xì)胞核有陽(yáng)性表達(dá)可作為陽(yáng)性對(duì)照。正常結(jié)直腸組織均有 MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白胞核表達(dá)，染色深呈棕褐色。只要一個(gè)蛋白表達(dá)缺失即認(rèn)為錯(cuò)配修復(fù)蛋白功能缺陷。在238例中共有40例伴有1種到3中錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失，總?cè)笔试?6.8%（40/238）。有錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失的病例與發(fā)病年齡的相關(guān)系數(shù)r=0.012，與腫瘤的分化的相關(guān)系數(shù)r=0.013，均沒(méi)有相關(guān)性。

2.2 MSH2與MSH6蛋白缺失有相關(guān)性，MLH1和PMS2蛋白的缺失率有相關(guān)性。在238例結(jié)直腸癌組織中，13例 MLH1蛋白表達(dá)缺失，其中伴有11例PMS2蛋白同時(shí)表達(dá)缺失，MLH1和PMS2蛋白的缺失率有相關(guān)系數(shù)r=0.70。15 例MSH2 表達(dá)缺失，其中有13例同時(shí)伴有MSH6蛋白表達(dá)缺失，MSH2與MSH6蛋白缺失有相關(guān)性（r=0.71）。MLH1與MSH2、MSH6蛋白缺失無(wú)相關(guān)性（r=-0.03、r=-0.01），PMS2與MSH2、MSH6蛋白缺失無(wú)相關(guān)性（r=-0.008、r=-0.02）。

2.3錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失組與無(wú)缺失組在發(fā)病年齡、性別及腫瘤的分化方面均無(wú)差異性。在238例結(jié)直腸癌中，女性113例，占47.5%，男性125例，占52.5%。在錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失組，女性19例，占47.5%，男性患者21例，占52.5，與總體性別比例完全一致，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。由于錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失組中，高分化腫瘤之占4例，病例數(shù)較少，不宜做χ2檢驗(yàn)，但是腫瘤的分化的相關(guān)系數(shù)r=0.013，可以判定錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失與腫瘤分化沒(méi)有相關(guān)性，見(jiàn)表1。

3討論

近年的研究發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）為結(jié)直腸癌發(fā)病的另一重要機(jī)制，是遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（hereditary non-polyposis colorectal cancer HNPCC）及部分散發(fā)性結(jié)直腸癌發(fā)生的重要原因。目前關(guān)于微衛(wèi)星不穩(wěn)定的研究不僅僅局限于發(fā)病機(jī)制上，其與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系也密切相關(guān)。錯(cuò)配修復(fù)基因功能異常使其不能產(chǎn)生正常的具有糾正錯(cuò)配功能的缺陷性蛋白質(zhì)，而導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定。散發(fā)性MSI結(jié)直腸癌常由于MMR基因的甲基化導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)蛋白不表達(dá)從而使DNA復(fù)制錯(cuò)誤增加、微衛(wèi)星不穩(wěn)定而使腫瘤發(fā)生。由于MLH1、PMS2、MSH2、MSH6表達(dá)的減少預(yù)示著腫瘤細(xì)胞處于微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)[5]，對(duì)這四項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的檢測(cè)的吻合率達(dá)99%。

從已經(jīng)發(fā)表的數(shù)據(jù)來(lái)看，各個(gè)研究小組間對(duì)錯(cuò)配修復(fù)蛋白的缺失率、與腫瘤的分化、發(fā)病年齡、以及不同蛋白間的不同相關(guān)性的研究結(jié)果不盡一致。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析來(lái)看，散發(fā)性結(jié)直腸癌組織中錯(cuò)配修復(fù)蛋白的缺失率為16.8%（40/238），與腫瘤的分化、發(fā)病年齡、性別方面均無(wú)相關(guān)性（r值均在-0.1～0.1）。

人類錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)對(duì)堿基的識(shí)別遵守甲基導(dǎo)向機(jī)制，也是利用DNA兩條鏈甲基化狀態(tài)的差異，識(shí)別含錯(cuò)配的子鏈。人類MMR作用的機(jī)理是；首先MSH2與MSH6形成的MUTS-A二聚體，在由MLH1和PMS2形成的二聚體MUTL-A協(xié)助下，特異性地識(shí)別并修復(fù)單個(gè)錯(cuò)配，插入或缺失的堿基。HMUTS-B（HMSH2/HMSH3蛋白二聚體）在MUTL-A及MUTL-B（MLH1/PMS1蛋白二聚體）協(xié)助下，特異性識(shí)別并修復(fù)較大片斷的插入或缺失[6]。而在某些研究小組的資料卻顯示MLH1與MSH2具有相關(guān)性。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的舒服分析可以看出，MSH2與MSH6蛋白缺失有相關(guān)性，MLH1和PMS2蛋白的缺失率有相關(guān)性。MLH1與MSH2、MSH6蛋白缺失無(wú)相關(guān)性（r=-0.03、r=-0.01）。

目前我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，而MSI+結(jié)直腸癌的特征對(duì)篩選具有遺傳性非息肉病行結(jié)直腸癌，以及對(duì)化療藥物的選擇性應(yīng)用有著顯著的應(yīng)用價(jià)值，都對(duì)臨床治療有重要指導(dǎo)意義。錯(cuò)配修復(fù)蛋白的檢測(cè)可以很好的反應(yīng)微衛(wèi)星不穩(wěn)定，其與結(jié)直腸癌的發(fā)生、治療、預(yù)后的相關(guān)研究有待進(jìn)一步的深入。

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