硫辛酸對(duì)糖尿病腎病大鼠的AGEs及氧化應(yīng)激影響的實(shí)驗(yàn)研究

摘要：目的 探討硫辛酸對(duì)DN大鼠AGEs及氧化應(yīng)激影響。方法 30只Wistar大鼠隨機(jī)取6只作正常對(duì)照組，余鏈脲佐菌素（STZ）2次腹腔注射造模，糖尿病腎病大鼠按血糖水平隨機(jī)分為糖尿病腎病組（B組）和LA組（C組），分別給予生理鹽水和LA（50 mg/Kg/d）1 mL腹腔注射4 w。測定各組體重、隨機(jī)血糖、24 h尿白蛋白、FPG、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、HDL-C、LDL-C、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗凝血糖化血紅蛋白（GHbA1c）、血清晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）、腎臟RAGE基因表達(dá)。結(jié)果 糖尿病腎病組及LA組TG、TC、HDL-C、LDL-C、GHbA1c、AGEs、MDA、水平顯著高于正常對(duì)照組；與B組比較，C組MDA下降，血SOD、GSH-Px均增加，SOD的差異有顯著性；C組和B組均檢測到腎臟組織RAGE的表達(dá)，正常對(duì)照組未檢測到RAGE表達(dá)。結(jié)論 DN時(shí)循環(huán)和腎組織局部AGEs含量增高，RAGE表達(dá)上調(diào)，LA可通過減少氧化應(yīng)激而抑制AGEs生成及下調(diào)RAGE表達(dá)，進(jìn)而改善DN大鼠腎組織結(jié)構(gòu)和腎功能。

關(guān)鍵詞：氧化應(yīng)激；AGEs；RAGE；糖尿病大鼠；糖尿病腎病

糖尿病腎病是嚴(yán)重的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，高血糖引起自由基蓄積，氧化應(yīng)激水平升高[1]，導(dǎo)致腎臟組織損傷，推動(dòng)DN的發(fā)生發(fā)展。本研究主要目的是利用長期高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素，制備2型糖尿病腎病大鼠模型，探討硫辛酸對(duì)糖尿病腎病大鼠的AGEs及氧化應(yīng)激的影響，并觀察腎臟RAGE的表達(dá)情況。

1資料與方法

1.1主要試驗(yàn)儀器與藥品 血糖儀及相應(yīng)試紙（Biosen C-line Diagnostic），HITACHI 7180生化分析儀（日本日立公司），高速冷凍離心機(jī)GL-20G-Ⅱ（上海安亭科學(xué)儀器廠），MDF-382E型Ultra-low Temperature Freezer（日本SANYO電子化學(xué)有限公司）， RF5301PC型紫外熒光分光光度計(jì)（日本島津）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：購自Sigma Chemical Co，USA，魚精蛋白鋅長效胰島素注射液：10 mL：400單位，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只健康雌性Wistar大鼠，3個(gè)月齡，均重（276.36±7.79）g，購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXR（魯）20030004，室溫（22±2）℃，12 h（8∶00～20∶00）光照交替，自由攝入標(biāo)準(zhǔn)固體顆粒飼料（含1.13%鈣、0.66%磷，山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）和自來水。

1.3方法 實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)取6只作正常對(duì)照組（A組），喂以普通飼料。余24只大鼠作糖尿病造模組，高糖高脂飼料喂養(yǎng)8 w（不限每日熱量），禁食12 h后左下腹腔注射STZ （30 mg/Kg，1次/2 w，共2次），正常對(duì)照組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。末次STZ注射1 w后糖尿病造模組行腹腔內(nèi)葡萄糖耐量試驗(yàn)（大鼠禁食6～8 h，按2 g/Kg體重腹腔注射30%葡萄糖溶液，尾靜脈采血測血糖，以FPG≥7.0 mmol/L，或糖負(fù)荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L者為糖尿病造模成功鼠）。持續(xù)觀察8 w，以隨機(jī)血糖≥16.0 mmol/L伴胰島素敏感性下降，并出現(xiàn)微量白蛋白尿?yàn)樘悄虿∧I病造模成功鼠，并按血糖水平隨機(jī)分為糖尿病腎病組（B組）和LA組（C組），分別給予生理鹽水和LA（50 mg/Kg/d） 1 mL腹腔注射4 w，每周按體重調(diào)整各組注射劑量。

1.4標(biāo)本收集與檢測 所有動(dòng)物收集24 h尿。處死前禁食16 h并稱重。心室取血處死大鼠，血液靜置2 h后，3000 rpm離心10min，分離血清，-20℃保存?zhèn)渥魃瘶?biāo)志物及有關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)測定；仰臥位固定大鼠，沿腹正中線逐層打開腹腔，切取右腎，去掉被膜，冰凍保存于-80℃液氮中，用于提取腎臟RNA。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以（x±s）表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0 處理。組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（independent sample t test）。差異顯著性水平為雙尾0.05。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1三組大鼠血AGEs、胰島素及胰島素抵抗等的變化 與A組比較，B組和C組大鼠血AGEs、HbA1c、FPG、FINS升高，差異有顯著性（P<0.05或P<0.01）；與B組大鼠比較，C組大鼠血AGEs、HbA1c、FPG、FINS下降（P<0.05），見表1。

2.2三組大鼠血脂、24 h尿蛋白水平的變化 與A組比較，B組大鼠血TC、TG、LDL-C、24 h尿蛋白均升高，差異有顯著性（P<0.05或P<0.01），說明存在脂代謝紊亂及腎損害；與B組大鼠比較，C組大鼠血TC、TG、LDL-C、24h尿蛋白下降（P<0.05）；三組大鼠HDL-C無明顯變化，見表2。

2.3三組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化 與A組比較，B組大鼠血MDA升高，差異有顯著性（P<0.05），而SOD、GSH-Px均下降，與B組比較，C組血MDA下降，血SOD、GSH-Px均增加，但GSH-Px差異無顯著性，見表3。

2.4三組大鼠腎臟RAGE的RT-PCR結(jié)果 腎組織總RNA OD260/OD280均1.7～2.0，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳示28S與18S的光密度比值約為2。LA組和糖尿病腎病組均檢測到腎臟組織RAGE的表達(dá)，正常對(duì)照組未檢測到RAGE表達(dá)。

2.5相關(guān)性分析 LA組大鼠MDA水平與FINS、IAI、TC、TG、LDLC呈顯著正相關(guān)，SOD水平與FINS、IAI、TC、TG、LDLC呈顯著負(fù)相關(guān)；LA組大鼠AGEs與MDA、24 h尿蛋白呈顯著正相關(guān)，而與SOD、GSH-Px呈顯著負(fù)相關(guān)。

3討論

實(shí)驗(yàn)顯示，糖尿病造模成功組與正常對(duì)照組相比，F(xiàn)INS、IRI、TC、TG、LDLC等明顯升高（P<0.05）， 而與B組比較，C組治療4 w后上述指標(biāo)顯著下降（P<0.05）。證實(shí)硫辛酸可改善2型糖尿病糖脂代謝，且LA組大鼠的MDA水平與FINS、IRI、TC、TG、LDLC呈顯著正相關(guān)，SOD水平與之呈顯著負(fù)相關(guān)，可能與LA通過增強(qiáng)胰島素受體激酶、胰島素受體基質(zhì)-1、磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B等活性，介導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUTl和GLUT4向胞膜易位，增強(qiáng)葡萄糖的代謝有關(guān)[2]。高脂血癥在2型糖尿病的腎損傷中起重要作用，有研究表明高膽固醇血癥可誘發(fā)或加重腎小球硬化和小管間質(zhì)損傷[3]。胰島素抵抗與腎臟的哪些病理改變有關(guān)目前仍不清楚，但它在2型糖尿病腎損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用[4]，而LA可增加血中脂蛋白酯酶（LPL）、肝酯酶（HL）活性[5]并穩(wěn)定血脂水平，與本實(shí)驗(yàn)研究一致。

氧化應(yīng)激通過直接損傷足細(xì)胞、改變腎小球血管通透性、增強(qiáng)炎癥反應(yīng)等諸多途徑參與糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展[6]，本實(shí)驗(yàn)顯示與B組比較，C組血MDA下降，SOD、GSH-Px均增加，24 h尿蛋白減少，證實(shí)LA可明顯改善糖尿病大鼠氧化應(yīng)激水平并降低尿蛋白排泄，對(duì)腎臟有一定保護(hù)作用。有研究表明AGEs在腎臟組織積聚是導(dǎo)致糖尿病腎病的重要因素[6]，本實(shí)驗(yàn)檢測到糖尿病腎病組大鼠的GHb水平明顯升高（P<0.01），AGEs熒光值明顯降低（P<0.01），也證實(shí)糖尿病腎病大鼠腎組織內(nèi)非酶糖基化作用增強(qiáng)。AGEs具有多種受體，目前研究較多的RAGE在糖尿病動(dòng)物模型中視網(wǎng)膜、系膜細(xì)胞和主動(dòng)脈上均有高水平表達(dá)，并促進(jìn)腎小球硬化，本實(shí)驗(yàn)LA組和糖尿病腎病組均檢測到腎臟組織RAGE表達(dá)，對(duì)照組未檢測到。硫辛酸治療后，血AGEs、MDA水平較腎病組明顯下降（P<0.05），SOD有所增加，且AGEs與MDA、24 h尿蛋白呈顯著正相關(guān)，而與SOD、GSH-Px呈顯著負(fù)相關(guān)，說明DN時(shí)ROS產(chǎn)生增加，自由基清除能力下降，使用LA有降低糖尿病腎病大鼠晚期糖基化作用，降低循環(huán)和腎組織局部的AGEs含量，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，并減少RAGE mRNA和蛋白在腎臟組織表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮腎保護(hù)作用，在DN的防治中有良好的應(yīng)用前景。

綜上所述，本研究證實(shí)硫辛酸可以通過減少氧化應(yīng)激而抑制AGEs生成及下調(diào)RAGE表達(dá)，降低尿蛋白，進(jìn)而減緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

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編輯/張燕