外泌體在移植物抗宿主病中的作用及其miRNA作為生物標(biāo)志物①

劉信如 沈佐君 （中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230001）

目前，造血干細(xì)胞移植是治療血液病最有效的方法之一。但異基因造血干細(xì)胞移植后有一定概率伴隨免疫觸發(fā)過程，并會導(dǎo)致嚴(yán)重免疫失調(diào)和器官損傷，即急性移植物抗宿主?。╝cute graft-versushost disease，aGVHD）［1］。移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）最初根據(jù)異基因造血干細(xì)胞移植后發(fā)病時(shí)間分為aGVHD和慢性GVHD（chronic graft versus host disease，cGVHD）。移植后100 d內(nèi)發(fā)生排斥反應(yīng)的稱為aGVHD，而＞100 d者稱為cGVHD［2］。根據(jù)臨床癥狀和病因新評分系統(tǒng)描述，aGVHD的臨床表現(xiàn)涉及皮膚、胃腸道和肝臟紊亂，經(jīng)常表現(xiàn)為皮疹、腹瀉、膽紅素升高，并與反復(fù)感染有關(guān)［3］。死亡風(fēng)險(xiǎn)因GVHD分期和分級而異［4］。目前診斷手段主要為基于典型癥狀的臨床診斷或必要時(shí)的活組織病理檢查，對患者有一定傷害［5］。已有明確臨床癥狀時(shí)進(jìn)行病理檢查確診GVHD治療效果往往不佳，且無法提前預(yù)判。糖皮質(zhì)激素和其他免疫抑制劑是目前GVHD預(yù)防的一線藥物，但會產(chǎn)生毒副作用［6］。因此，迫切需要新的治療方案和靶點(diǎn)改進(jìn)GVHD治療效果。

1 外泌體概述

外泌體是一種與質(zhì)膜融合后釋放到細(xì)胞外環(huán)境的小膜囊泡，具有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)，直徑為30～100 nm，幾乎可被來自不同生物體的所有細(xì)胞產(chǎn)生并分泌，如肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，并廣泛存在于各種生物體液中，如人體血液、尿液、唾液、乳汁、精液、羊膜液、腹水、關(guān)節(jié)液及腦脊液等，且可從這些體液中被無創(chuàng)提取出來［7-12］。外泌體含有多種生物大分子，主要為蛋白質(zhì)和核酸［13］。蛋白質(zhì)可分為參與其結(jié)構(gòu)形成的結(jié)構(gòu)蛋白及作為外泌體標(biāo)志的特異蛋白，如CD9、CD63、CD81和HSP70等［14］。核酸包括DNA、mRNA、ncRNA等。外泌體由于其雙層膜結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢在體液中高度穩(wěn)定，即使在腫瘤免疫微環(huán)境、低氧、氧化應(yīng)激和致病因素等條件下所受干擾也較小，且通過膜融合、受體-配體作用、胞吞作用等將核酸等信息傳入靶細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞間通訊［15］。這些特性使其具有作為治療策略的潛在應(yīng)用前景，而外泌體中的miRNA則是最常見的疾病生物標(biāo)志物之一。

2 外泌體調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答

2.1 免疫或調(diào)節(jié)細(xì)胞釋放的外泌體 既往研究已觀察到免疫或調(diào)節(jié)細(xì)胞釋放的外泌體可部分調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。如ZHANG等［16］研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞產(chǎn)生的CD39+CD73+外泌體能夠?qū)⒛[瘤細(xì)胞中的ATP水解為腺苷，進(jìn)而抑制化療后的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。另有研究證明，T細(xì)胞來源外泌體（T-exo）可在免疫突觸形成過程中轉(zhuǎn)移到樹突狀細(xì)胞，并導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞基因表達(dá)變化，包括免疫應(yīng)答相關(guān)基因［17］。ZHANG等［18］發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞釋放的外泌體可抑制CD8+T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性反應(yīng)。而AGARWAL等［19］研究認(rèn)為Treg來源外泌體（Treg-exo）具有免疫抑制作用，樹突狀細(xì)胞分離的外泌體能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。

2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）釋放的外泌體 MSC是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的多功能非造血前體細(xì)胞，可以很容易地從不同人體組織中分離，具有免疫調(diào)節(jié)特性，既影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答，也影響先天免疫應(yīng)答［20-21］。近期研究提示MSC是一種有潛力的細(xì)胞，在GVHD治療中展現(xiàn)了優(yōu)越作用，越來越多的證據(jù)表明，MSCs的旁分泌效應(yīng)可能部分由MSC衍生的外泌體介導(dǎo)，加上外泌體的特有優(yōu)勢，MSC-exo吸引了研究者的興趣。一項(xiàng)來自人BM-MSC-exo的蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析顯示，MSC-exo中有1 927個(gè)蛋白質(zhì)，而MSCs中有6 342個(gè)蛋白質(zhì)［22］。EIRIA等［23］RNA測序顯示，與 MSCs相比，miR-148a、miR-532、let-7f及miR-378在MSC-exo中含量更為豐富。REIS等［24］通過microRNA圖譜鑒定出49種miRNA，在外泌體中富集顯著高于親代MSC。表明MSCs發(fā)揮的效應(yīng)可能由MSC-exo介導(dǎo)，并得到了證實(shí)和應(yīng)用，MSC-exo已作為一種替代治療工具用于各種免疫疾病臨床前模型，包括aGVHD。MSC-exo的免疫調(diào)節(jié)作用也逐漸被闡明。

2.2.1 MSC-exo調(diào)控非特異性免疫 MSC-exo的免疫調(diào)節(jié)作用是通過抑制淋巴細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞向抗炎型分化發(fā)揮的。調(diào)控非特異性免疫方面，MSC-exo可作用于巨噬細(xì)胞，LI等［25］研究表明，MSC-exo可抑制巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，并提高抗炎因子IL-10水平，下調(diào)促炎因子IL-1β和TNF-α水平。ZHAO等［26］發(fā)現(xiàn)，MSC-exo通過激活STAT3轉(zhuǎn)錄促使巨噬細(xì)胞向M2型極化，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。NK細(xì)胞是體內(nèi)發(fā)揮重要作用的免疫細(xì)胞，研究表明，人胎肝MSC-exo可抑制NK細(xì)胞增殖、活化及細(xì)胞毒性［27］。樹突狀細(xì)胞與MSCs研究發(fā)現(xiàn)，在未成熟樹突狀細(xì)胞向成熟型轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基中加入骨髓MSC-exo，誘導(dǎo)得到的樹突狀細(xì)胞CD80、CD86、CD83分子表達(dá)減少，炎癥因子TNF-α、IL-12分泌減少，而抗炎因子IL-10、TGF-β分泌增加，上調(diào)抗炎因子水平可促進(jìn)Treg增殖和免疫抑制作用［28］。

2.2.2 MSC-exo調(diào)控特異性免疫 MSC-exo在調(diào)控特異性免疫方面也有重要作用。CHEN等［29］將骨髓MSC-exo和外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示其能促進(jìn)輔助性T細(xì)胞Th1向Th2轉(zhuǎn)換，顯著減少促炎因子IL-1β和TNF-α，提高抗炎因子TGF-β水平。BUDONI等［30］研究表明，MSC的微泡可抑制B細(xì)胞增殖和抗體分泌，且具有劑量依賴性。

2.2.3 MSC-exo發(fā)揮作用實(shí)例 鑒于MSC-exo的免疫調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)性細(xì)胞衍生外泌體已被建議作為無細(xì)胞治療工具抑制GVHD期間免疫系統(tǒng)過度激活［31］。已有研究逐步證明了MSC-exo對GVHD的治療效果。HCT臨床環(huán)境下，BM-MSC-exo已安全地用于治療1例類固醇難治性皮膚和腸道Ⅳ級GVHD患者［32］。外泌體輸注可顯著改善GVHD癥狀，其攜帶抗炎分子，不攜帶促炎細(xì)胞因子和凋亡誘導(dǎo)分子，證實(shí)了MSC-exo作為抗炎和免疫調(diào)節(jié)遞質(zhì)的有益作用，為GVHD的治療方案提供了新的方向。

3 miRNA作為生物標(biāo)志物

miRNA是一類非編碼小RNA，屬于短鏈RNA，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，存在于人體的血液、尿液等體液中，參與體內(nèi)各種生物學(xué)過程，在基因表達(dá)中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后水平［33］。通過誘導(dǎo)信使RNA降解或轉(zhuǎn)錄抑制負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)。近年日益增多的研究報(bào)道了miRNA在各種疾病中的作用，2007年，VALADI等［34］最早從外泌體中發(fā)現(xiàn)了miRNA，并證實(shí)miRNA可通過外泌體在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，且外泌體的脂質(zhì)雙層囊泡結(jié)構(gòu)可作為生物活性分子載體，miRNA被包裹在外泌體中，避免了被RNaseA催化降解，因此exo-miRNA作為疾病生物標(biāo)志物具有極大優(yōu)勢［15］。已有研究證明血漿中的多種miRNA在GVHD中發(fā)揮作用。

3.1 血液循環(huán)miRNA在GVHD中的作用 2012年RANGANATHAN 等［35］首次報(bào)道 miR-155在 GVHD調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，且miR-155在aGVHD小鼠T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。該團(tuán)隊(duì)5年后又報(bào)道了血清miR-29a表達(dá)也在aGVHD診斷前2周升高，為aGVHD防治提供了新的靶點(diǎn)［36］。XIAO等［37］通過分析aGVHD患者血漿miRNA發(fā)現(xiàn)，aGVHD患者血漿中miR-423、miR-199a-3p、miR-93*、miR-377、miR-155和 miR-30a等6個(gè)miRNAs表達(dá)顯著高于非GVHD患者，并建立了包括4個(gè)miRNA（miR-423、miR-199a-3p、miR-93*和miR-377）、AUC=0.8的GVHD預(yù)測模型。CROSSLAND等［38］再次證實(shí)了這個(gè)結(jié)果，且外泌體中miRNA研究發(fā)現(xiàn)，與循環(huán)中的外泌體相比，非aGVHD患者外泌體中部分miR-423、miR-199和miR-93*表達(dá)較高，證實(shí)了循環(huán)miR-423、miR-199和miR-93*作為aGVHD診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的能力，表明其差異表達(dá)在aGVHD病因?qū)W中具有潛在作用。ZHANG等［39］利用TaqMan微RNA陣列分析血清中的miRNA得出miR-411在aGVHD發(fā)生和恢復(fù)時(shí)顯著下調(diào)的結(jié)論，開發(fā)并驗(yàn)證了包括2個(gè)miRNA（miR-26b和miR-374a）的aGVHD預(yù)測和診斷模型，可提前1～2周預(yù)測 aGVHD增加風(fēng)險(xiǎn)。XIE等［40］通過RT-PCR檢測血清miRNAs，也證明了GVHD患者miR-155表達(dá)顯著上調(diào)，與既往研究結(jié)果一致，可能成為aGVHD患者的潛在靶向治療策略。2年后該團(tuán)隊(duì)以同種方法檢測到aGVHD患者血液中miR-181a-3p表達(dá)顯著提高，具有敏感性和特異性，可能成為aGVHD患者識別、診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物［41］。WANG等［42］報(bào)道了 miR-586作為aGVHD 新型生物標(biāo)志物的可能性，實(shí)時(shí)定量PCR檢測了52例患者aGVHD前、aGVHD開始時(shí)和aGVHD后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血漿標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)生Ⅰ～Ⅱ級aGVHD時(shí)血漿miR-586水平降低，感染時(shí)血漿miR-586水平升高，且aGVHD組miR-586表達(dá)明顯高于非aGVHD組。GIMONDI等［43］鑒別出 miR-194 和 miR-518f可能成為早期診斷aGVHD的標(biāo)志物，與非aGVHD患者相比，aGVHD患者miR-194和miR-518f表達(dá)顯著上調(diào)。ATAROD等［44］發(fā)現(xiàn)，aGVHD患者血清miR-503-5p、miR-34a-5p和miR-34a-3p表達(dá)均顯著高于非aGVHD患者，且miR-34a-3p和miR-503-5p間統(tǒng)計(jì)交互作用可診斷aGVHD。ZHAO等［45］基于microRNA聚合酶鏈反應(yīng)的芯片技術(shù)篩選出miR-153-3p作為aGVHD的潛在生物標(biāo)志物，且移植后7 d血漿miR-153-3p水平升高，可用于預(yù)測aGVHD發(fā)生。miRNA作為生物標(biāo)志物在多項(xiàng)疾病中的作用已被證實(shí)，在GVHD中也不例外，目前血液循環(huán)miRNA在GVHD中作為生物標(biāo)志物的可能性已有多項(xiàng)研究，也發(fā)現(xiàn)了多個(gè)潛在生物靶點(diǎn)，為GVHD診斷及治療帶來了曙光。

3.2 外泌體miRNA在GVHD中的作用 目前報(bào)道中，外泌體miRNA作為GVHD的生物標(biāo)志物較少，中國知網(wǎng)和web of science檢索了相關(guān)中文和英文文獻(xiàn)后，最終納入2篇文獻(xiàn)結(jié)果進(jìn)行綜述。劉嬌等［46］篩選出 3 個(gè) miRNA（miR-3976、miR-122-5p、miR-3125）在aGVHD中顯著上調(diào)，而miR-941、miR-4687-5p和miR-4769-5p顯著下調(diào)。YOSHIZAWA等［47］采用TaqMan低密度芯片進(jìn)行exo-miRNA表達(dá)譜分析，最終證實(shí)miR-128在LA GVHD發(fā)病時(shí)明顯上調(diào)，miR-128高表達(dá)可作為LA GVHD早期診斷新的、無創(chuàng)生物標(biāo)志物。提示外泌體miRNA作為無創(chuàng)生物標(biāo)志物的潛力，值得繼續(xù)探索。

4 總結(jié)與展望

目前診斷方法延誤了GVHD的治療時(shí)機(jī)，是導(dǎo)致其治療效果不佳的原因之一，發(fā)展一種簡單易行的早期診斷方法對及時(shí)治療具有重要意義。miRNA這種具有多種優(yōu)勢的標(biāo)志物已被初步證明有效，在其他腫瘤中已被作為診斷標(biāo)志物，能否成為GVHD的早期診斷標(biāo)志物值得深入探索。包裹在外泌體中的miRNA的穩(wěn)定性提示其具有更為廣闊的應(yīng)用前景。在外泌體中篩選miRNA標(biāo)志物可能為早期篩選GVHD、降低GVHD發(fā)病率提供有效方案。