間充質(zhì)干細胞治療自閉癥的研究進展①

楊淑鈞 申 晨 李 萌 曹 霞 （昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院中心實驗室，昆明 650101）

自閉癥譜系障礙（autism spectrum disorders，ASD）是一種異質(zhì)性精神發(fā)育障礙性疾病，其基本特征是社交技能和認知靈活性嚴重受損［1］。男孩患自閉癥的概率比女孩高3～4倍。根據(jù)美國相關調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近10年來，自閉癥患病率由1/125上升至1/59，而我國自閉癥患者數(shù)量也在逐年攀增，僅6～12歲兒童中ASD患者數(shù)量就高達70～100萬例，ASD被認為是增長最快的發(fā)育障礙性疾?。?］。但由于ASD是多因素導致的，其具體發(fā)病機制尚不明確，患者在癥狀、智力水平、嚴重程度和功能障礙方面差異很大，因此至今無法治愈。現(xiàn)有的常規(guī)干預措施療效有限，促使研究者們在細胞和分子水平上尋找針對ASD病變的生物學療法［3］。干細胞移植對于患有無法治愈的腦部疾病的患者具有良好的治療潛力，且有研究表明細胞移植可能影響與ASD相關的病理生理機制，因此提出了基于干細胞的再生療法來治療ASD。而間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是臨床研究中最常用的細胞，具有強大的增殖能力和多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)功能、旁分泌再生功能、神經(jīng)保護作用等，可通過誘導免疫調(diào)節(jié)治療腦部疾病、增強神經(jīng)發(fā)生、提高神經(jīng)營養(yǎng)因子水平，且其來源豐富，采集方便，免疫原性低，這些都體現(xiàn)了其治療ASD的潛力［4-5］。本文總結了近年來通過移植MSCs治療自閉癥的研究結果，為采用MSCs治療自閉癥提供重要線索。

1 自閉癥的治療現(xiàn)狀

由于自閉癥本身發(fā)病機制的復雜性，導致患者在發(fā)病癥狀、嚴重程度上差異很大，因此只能根據(jù)其核心癥狀和相關癥狀進行觀察性方法和心理檢測診斷。美國出版的《精神疾病診斷和統(tǒng)計手冊》通常被用作自閉癥診斷的金標準［3］。

對于ASD的治療，現(xiàn)有的治療方法可分為藥理、營養(yǎng)和行為學方法，但不存在定義的標準方法。藥理學方法一般針對ASD相關的神經(jīng)精神癥狀，如易怒和多動等相關癥狀，常用藥有精神刺激藥、非典型抗精神病藥、抗抑郁藥、抗驚厥情緒穩(wěn)定劑等，但目前尚無藥物被批準用于治療自閉癥的核心癥狀。其他治療方法包括非精神藥物治療（乙酰膽堿酯酶抑制劑、肉堿、維生素C）、反復經(jīng)顱磁刺激治療法、激素治療法（褪黑素、催產(chǎn)素和加壓素）、免疫調(diào)節(jié)和抗炎治療。行為治療是自閉癥的有效干預策略，包括早期強化認知行為療法、言語治療、社交技能培訓、特殊教育和職業(yè)培訓、音樂療法，然而，尚無明確的行為干預治療方法可完全改善自閉癥患者的所有癥狀［6-8］。如何更好地治療ASD仍需進一步研究。

目前，新型治療方法有基因治療和干細胞治療［3，9］。鑒于ASD患者的免疫失調(diào)，干細胞療法已被提出并應用于自閉癥治療。其中，MSCs所具有的免疫學特性使其成為治療ASD的候選細胞。

2 MSCs治療自閉癥的機制

干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞。有研究指出，干細胞的旁分泌、免疫調(diào)節(jié)作用是治療ASD的潛在機制［10］。ASD患者是患有精神疾病的群體，其大腦中的神經(jīng)發(fā)生通常緩慢而有限，且ASD患者表現(xiàn)出先天性和適應性免疫失衡，其免疫系統(tǒng)通常產(chǎn)生異常且強烈的促炎細胞因子，這些改變會導致長期免疫失調(diào)［11］；相關研究表明，ASD患者大腦的某些神經(jīng)細胞（星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞及浦肯野細胞等）形態(tài)與數(shù)量存在異常［12］。而干細胞的免疫調(diào)節(jié)和分化能力可恢復這些免疫改變和神經(jīng)發(fā)生。因此，在許多研究中，干細胞被用來治療ASD，并展現(xiàn)出很好的治療效果。

MSCs是干細胞家族的重要成員，是中胚層起源的祖細胞群，最早在含量豐富的骨髓中發(fā)現(xiàn)，之后發(fā)現(xiàn)其也存在于胎盤、臍帶、脂肪等組織中，具有強大的增殖能力和多向分化能力，還有免疫調(diào)節(jié)功能、來源方便、易于分離培養(yǎng)、表面抗原不明顯、異體移植排異較輕等特點。目前，MSCs已廣泛運用于血液系統(tǒng)疾病、心血管疾病、自身免疫疾病等研究中，在神經(jīng)系統(tǒng)修復方面具有長遠的發(fā)展前景，在醫(yī)學研究中顯示出良好效果［13-14］，許多研究人員將其用來治療ASD，無論是在動物實驗還是臨床研究中，ASD的癥狀都因此得到明顯緩解。

根據(jù)相關研究，MSCs的以下特點使其成為治療ASD的候選：①刺激宿主受損組織的可塑性反應，如炎癥性腸道疾??；②合成和釋放抗炎細胞因子和促進生存的生長因子（旁分泌）；③移植后，MSCs靶向遷移至損傷部位，對局部環(huán)境做出反應，如整合到現(xiàn)有的神經(jīng)和突觸網(wǎng)絡［10，15-16］；④不存在不可控的生長和腫瘤發(fā)生，不引起道德異議［17］。

典型的ASD患者表現(xiàn)出T細胞和B細胞介導的免疫功能改變，以及CD3+、CD4+、CD8+T細胞和自然殺傷（NK）細胞失衡，在此基礎上，MSCs介導的調(diào)節(jié)作用，如抑制CD8+/CD4+T淋巴細胞和NK細胞增殖，抑制漿細胞產(chǎn)生免疫球蛋白，抑制樹突狀細胞成熟等是恢復免疫平衡的最佳途徑，這是通過藥物干預無法獲得的［17］。其次，自閉癥患者中提取的外周血單核細胞過度產(chǎn)生IL-1β，導致長期免疫改變，而MSCs介導的免疫抑制活性（抑制TNF-α和IFN-γ的產(chǎn)生和增加IL-10水平）可以恢復這種免疫失衡［15］。另有證據(jù)顯示，自閉癥受試者的小腦浦肯野細胞數(shù)量減少，而移植的MSCs能夠促進突觸可塑性和功能恢復，并挽救小腦浦肯野細胞［18-19］。MSCs針對ASD相關異常改變做出的潛在改善作用如表1所示。

表1 MSCs治療ASD的機制Tab.1 Mechanism of MSCs for treatment of ASD

3 MSCs治療自閉癥動物模型（BTBR小鼠）的試驗

近交小鼠品系BTBR表現(xiàn)出ASD所有核心癥狀，且有遺傳穩(wěn)定性和商業(yè)可得性，是評估自閉癥樣行為的公認動物模型［20］。SEGAL-GAVISH 等［21］采用皮下注射的方式將MSCs移植于BTBR小鼠的側腦室，以假手術組為對照，檢測移植后的行為學變化和病理學變化，發(fā)現(xiàn)MSC移植組的刻板印象行為水平較對照組明顯降低（挖掘時間減少46%，梳理時間減少60%）；MSC組認知僵化強度降低，適應環(huán)境變化的靈活性提高（水迷宮試驗中的空間學習和記憶能力、轉輪試驗中的認知僵化指標改善）；社交互動試驗中，MSC組花費更多時間進行社交互動（三室試驗）；MSC組的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）較對照組增加36%，齒狀回中神經(jīng)干細胞增殖增加。2017年PERETS等［22］將MSCs分化為能分泌更高水平神經(jīng)營養(yǎng)因子的細胞（NurOwn?），并將其移植到BTBR小鼠側腦室，發(fā)現(xiàn)治療后NurOwn?組BTBR小鼠的社交行為得到明顯改善，雌雄間發(fā)聲次數(shù)增加，重復梳理的時間減少，認知靈活性得到明顯改善。首次顯示了可測量的所有行為表型的改善，且具有長達6個月的長期效果。而近期的另一項研究表明MSCs的治療作用主要是通過分泌包含重要分子信息的囊泡（MSC-exo）介導，該實驗僅對BTBR小鼠使用MSC-exo（鼻內(nèi)給藥）就可明顯改善所有ASD樣癥狀［23］。

4 MSCs治療自閉癥的臨床試驗

鑒于在這種疾病中觀察到的免疫和精神失調(diào)，2013年 LV等［24］研究了人臍帶血單核細胞（cord blood mononuclear cells，CBMNCs）與臍帶來源間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）聯(lián)合移植治療自閉癥兒童的安全性和有效性，37例（3～12歲）自閉癥患者參加了這項研究（分為CBMNC組、聯(lián)合組及對照組），受試者每周1次靜脈和4次鞘內(nèi)注射干細胞，未發(fā)現(xiàn)與治療相關的重大不良反應，且最后由兒童自閉癥評定量表（CARS）、臨床總體印象量表（CGI）和異常行為檢查表（ABC）顯示的結果表示：聯(lián)合移植CBMNCs和UCMSCs的效果優(yōu)于單獨移植CBMNCs。同年，SHARMA等［25］研究了將含有MSCs的自體骨髓單個核細胞（BMNC）經(jīng)鞘內(nèi)移植到32例（3～33歲）自閉癥患者體內(nèi)的療效，經(jīng)26個月的隨訪，發(fā)現(xiàn)96%的患者在各種行為量表上的得分均有所改善，體現(xiàn)出患者情緒反應、交流、認知及行為模式等方面的改善，但同時觀察到少數(shù)可用藥物控制的不良反應（癲癇和多動）。該研究表明細胞治療具有協(xié)同效應，還可能平衡大腦的新陳代謝。2019年，RIORDAN等［26］的一份研究調(diào)查了對ASD患兒使用同種異體UCMSC的安全性和有效性，20例（6～16歲）自閉癥患者每12周接受1次干細胞靜脈移植（與治療前進行自身對照），隨訪1年，在治療最后1次后3個月和12個月進行評估，發(fā)現(xiàn)治療過程中，與治療有關的不良事件（頭痛、發(fā)燒和疲勞）為輕度或中度，持續(xù)時間短，而且8例受試者的CARS和自閉癥治療評估清單（ATEC）得分下降，其中5例受試者血清炎癥細胞因子水平降低。2020年的一項研究評估了使用自體骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSCs）鞘內(nèi)注射治療ASD的安全性及有效性，通過將32例（5～15歲）患者隨機分為治療組和對照組，治療組患者在4周時間內(nèi)鞘內(nèi)注射2次BMMSCs，之后并未發(fā)現(xiàn)與注射相關的副作用，但并未達到預期的治療效果（僅CGI結果有微小的改善），該研究認為，盡管自體BMMSCs的使用是安全的，但考慮到昂貴、復雜的制備和注射過程及其微弱的療效，其性價比并不理想［27］。同時，現(xiàn)有的MSCs治療自閉癥的臨床試驗還較少，因此，不同MSCs治療ASD的安全性及有效性仍需進一步研究。

5 不足與缺陷

5.1 受試者數(shù)量相對較少 現(xiàn)有的臨床試驗使用的樣本量較少，以上案例多是基于少量受試者，50例受試者以上的相關研究極少，這或許是由于參與者自身或家庭因素以及對研究內(nèi)容不了解導致對最后結果的擔憂，使參加研究的人數(shù)較少，臨床研究樣本不足會對結果的可靠性造成一定影響［24］。

5.2 隨訪時間 盡管上述臨床試驗總體上報告了ASD患者進行MSCs移植治療的安全性，但現(xiàn)有的關于該研究的隨訪時間大多只有治療后的12個月，目前暫無長期影響的數(shù)據(jù)，但自閉癥的治療效果需要更長的時間觀察［3］。

5.3 療效評定 ASD的療效評定方法應通過國際認可、標準化，需要統(tǒng)一的量表進行評估，目前雖有美國出版的《精神疾病診斷和統(tǒng)計手冊》被用作自閉癥診斷的金標準，但干擾因素多，無法正確且穩(wěn)定地評估。使用MSCs治療自閉癥就可以對炎癥標志物進行檢測，先進的成像研究也可以更好地了解MSCs對ASD患者的生物學影響。盡管如此，因自閉癥的病情受生活環(huán)境和家庭因素差異的影響也較大，MSCs的后續(xù)治療效果也許會因此混淆。

5.4 細胞來源 現(xiàn)有的臨床研究中用于治療ASD的MSCs類型很多，如UCMSCs、同種異體UCMSCs、BMMSCs等，研究都證實了這種治療方法的安全性，但其療效并未得到統(tǒng)一的結果，因此需要進一步研究可能有效的MSCs?，F(xiàn)已知ASD有遺傳異質(zhì)性，因此ASD受試者體內(nèi)會存在某些遺傳修飾，所有細胞類型都保留這些改變。因此可以嘗試同種異體移植，但需要考慮捐助者的細胞獲得性和有可能的傳染病測試［26-27］。

5.5 給藥途徑及頻率 上文臨床研究中有靜脈移植和鞘內(nèi)注射，動物研究還使用過鼻內(nèi)給藥。靜脈給藥屬于全身給藥，無吸收過程且起效快；鞘內(nèi)注射屬于局部給藥，較靜脈注射更有針對性，可克服血-腦脊液屏障，使細胞隨腦脊液循環(huán)自然到達蛛網(wǎng)膜下腔，從而彌散在整個腦室系統(tǒng)，而不會造成任何神經(jīng)損傷；動物實驗的鼻內(nèi)給藥途徑可增加藥物的腦內(nèi)遞送，且鼻黏膜對抗原具有一定敏感性，但由于低滲透性和較高的代謝降解，因此對生物大分子的遞送有限制性，且有研究表示長期鼻內(nèi)給藥可能導致鼻黏膜完整性喪失。目前關于MSCs治療ASD的給藥途徑并無統(tǒng)一意見，且給藥頻率和劑量也沒有標準。這些都會影響患者配合度和治療效果，以致研究結果存在差異。

6 展望

盡管現(xiàn)有的研究都肯定了MSCs治療ASD的安全性和有效性，顯示出其潛在研究價值，但要想證明MSCs治療ASD的療效，還須對MSCs的作用機制進行更加深入、全面、詳盡的研究和大規(guī)模臨床試驗，以確定給藥后的組織分布、長期安全有效性及最佳干預年齡，從而更好地了解MSCs對自閉癥的治療效果及其機制［28］。