激光共聚焦顯微鏡在腫瘤研究方面的應(yīng)用

摘要：激光共聚焦顯微鏡（LSCM）是當(dāng)今世界上最先進(jìn)的分子細(xì)胞生物學(xué)分析儀器。它在熒光成像基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，利用紫外光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。目前在形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)都有廣泛地應(yīng)用，在腫瘤研究中更是成為新一代強(qiáng)有力的研究工具。

關(guān)鍵詞：激光共聚焦顯微鏡；腫瘤學(xué)；應(yīng)用

激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope， LSCM）是在熒光成像基礎(chǔ)上加裝激光掃描設(shè)備，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，使用紫外光激發(fā)熒光探針，以得到細(xì)胞或組織內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)的熒光圖像。激光共聚焦顯微鏡（LSCM）目前在形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到了很好的應(yīng)用，本文主要概述其在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用。

1基本原理

激光共聚焦顯微鏡（LSCM）利用激光掃描束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源，對標(biāo)本內(nèi)平面上的每一點(diǎn)掃描，標(biāo)本上的被照射點(diǎn)在探測針孔成像，由探測針孔后的光電倍增管或冷電耦合器件逐點(diǎn)或逐線接受，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏上形成熒光圖像，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔，得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的橫斷面，此外在顯微鏡的載物臺(tái)上加一個(gè)微量步進(jìn)馬達(dá)，使載物臺(tái)上、下移動(dòng)，最小步進(jìn)距離0.1μm，這樣細(xì)胞或組織各橫斷面的圖像都能清楚地顯示，實(shí)現(xiàn)\"光學(xué)切片\"的目的。

2熒光定性、定量

普通光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡僅能對腫瘤抗原進(jìn)行定性分析，而對多標(biāo)記細(xì)胞、組織標(biāo)本的抗原表達(dá)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征以及抗腫瘤藥的作用機(jī)制等方面進(jìn)行定量的觀察和監(jiān)測，只能借助激光共聚焦顯微鏡來實(shí)現(xiàn)。Raucher等[1]在研究Skov-3，HELA和FaDu細(xì)胞對于熱反應(yīng)性ELP（由重復(fù)的VPGXG組成的彈性蛋白樣多肽）的收時(shí)，以熒光標(biāo)記3個(gè)細(xì)胞系中熱反應(yīng)性ELP，通過LSCM定量觀察其吸收，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度高于其轉(zhuǎn)運(yùn)溫度時(shí)，細(xì)胞對于ELP的吸收度增加，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)階段的環(huán)境溫度來調(diào)控細(xì)胞對于ELP的吸收。

3細(xì)胞內(nèi)離子測量

LSCM可以精確地測量細(xì)胞內(nèi)Ca2+、K+、Na+、Mg2+等離子的含量。莫媛媛等[2]研究大黃素乙?；镒饔帽茄拾〤NE-1細(xì)胞后，其線粒體損傷及其與線粒體自噬的關(guān)系時(shí)，分別用5mg·L-1及10mg·L-1大黃素乙?；镒饔糜贑NE-1細(xì)胞，再利用激光共聚焦顯微鏡分別測定兩組細(xì)胞中線粒體膜電位，細(xì)胞內(nèi)Ca2+及線粒體自噬的活性。發(fā)現(xiàn)被大黃素乙?；镒饔煤蟮募?xì)胞，細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子濃度升高，且細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)酸性溶酶體增殖，其中包含線粒體探針標(biāo)記的線粒體碎片等典型的自噬特征，且增加的趨勢呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

4粘附細(xì)胞的分選

細(xì)胞分選有兩種方式：一種適用于數(shù)量較多細(xì)胞的分選，即在特制的培養(yǎng)皿上有作過熒光染色和未作熒光染色的兩類細(xì)胞群，利用高能激光把染色的細(xì)胞群殺死，而保留未染色的細(xì)胞群并繼續(xù)培養(yǎng)；另一種適用于數(shù)量較少的突變細(xì)胞，轉(zhuǎn)移細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞，即利用高能量激光于底部帶膜的特制配養(yǎng)皿上在欲選細(xì)胞周圍切割成八角帶，而非選細(xì)胞則因在該幾何形狀之外而去除。

5組織光學(xué)切片及三維圖像重建

標(biāo)本的各層光學(xué)切片經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理及三維重建軟件，可以得到其三維立體結(jié)構(gòu)，從而可以十分靈活直觀地觀察組織的立體形態(tài)和空間關(guān)系。封巍等[3]通過LSCM這一功能對轉(zhuǎn)染至食管癌TE-1細(xì)胞及卵巢癌SKOV3細(xì)胞內(nèi)反義VEGF寡核苷酸上熒光物質(zhì)含量進(jìn)行檢測，并對細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同組別細(xì)胞間的形態(tài)差異具有顯著診斷學(xué)意義。表明使用LSCM通過亞細(xì)胞形態(tài)學(xué)來對正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞作出精確診斷具可行性。Zhang等[4]使用LSCM對肝癌細(xì)胞、過度增生肝細(xì)胞及正常肝細(xì)胞作光學(xué)切片和三維圖像重建，對其細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞核是雜亂無章的，有異型，其染色體也是粗大不規(guī)則的，說明利用LSCM的三維圖像重建技術(shù)對于癌癥的診斷是十分有益的。

6間隙鏈接胞間通訊

間隙連接是動(dòng)物細(xì)胞中通過連接子進(jìn)行的細(xì)胞間連接。間隙連接的連接點(diǎn)處，雙脂層并不直接相連， 而是由兩個(gè)連接子對接形成通道，允許小分子的物質(zhì)直接通過這種間隙通道從一個(gè)細(xì)胞流向另一個(gè)細(xì)胞。間隙連接能在細(xì)胞間形成電偶聯(lián)和代謝偶聯(lián)。電偶聯(lián)在神經(jīng)沖動(dòng)信息傳遞過程中起重要作用。代謝偶聯(lián)可使小分子代謝物和信號分子通過間隙連接形成的水性通道， 從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞。目前，間隙連接胞間通訊（gap iunctions intercellular communication，GJIC）與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系日益受到重視。Ma等[5]使用LSCM觀察肝癌HHCC細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞和正常肝細(xì)胞QZG中的GJIC功能。結(jié)果表明GJIC的功能在正常肝細(xì)胞中明顯高于其他兩組。West印跡法表明，只有QZG細(xì)胞的CX32蛋白和CX43蛋白中有未經(jīng)磷酸化的酪氨酸存在，說明人類肝細(xì)胞癌的發(fā)生與CX基因的異常表達(dá)及其信號傳導(dǎo)通路的障礙有關(guān)。

7腫瘤耐藥機(jī)制的研究

由于LSCM具備組織光學(xué)切片和三維重建功能，能夠十分靈活直觀的觀察組織立體形態(tài)和空間關(guān)系，加之LSCM能隨時(shí)采集和記錄檢測信號，使其對腫瘤細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的檢測成為可能。

8結(jié)論

LSCM是一種新發(fā)展起來的檢測手段，因其高分辨率，特別是對細(xì)胞內(nèi)離子的定量檢測，完整、清晰的細(xì)胞三維立體結(jié)構(gòu)圖像重建方面，是傳統(tǒng)光鏡和電鏡所不能比擬的。它越來越引起醫(yī)學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。近年來在腫瘤研究中得到廣泛的應(yīng)用。目前，LSCM與光鏡、電鏡、流式細(xì)胞儀相結(jié)合已成為腫瘤研究的一大趨勢。

參考文獻(xiàn)：

[1]Raucher D，Chllkoti A.Enhanced uptake of a thermally responsive polypeptlde by tumor cells in response to its hyperthermla-mediated phase transition[J].Cancer Res，2001，61（19）：7163-7170.

[2]莫媛媛，侯華新.大黃素乙?；镏卤茄拾〤NE-1細(xì)胞線粒體自噬活性的研究[J].中國癌癥防治雜志，2014，6（1）：1-3.

[3]封巍，鄭曉.激光共聚焦顯微鏡對反義VEGF寡核苷酸轉(zhuǎn)染 TE-1及SKOV3細(xì)胞系的光檢測[J].腫瘤學(xué)雜志，2011，17（2）：111-114.

[4]Zhang WH，zhu SN， Lu SL，et al.Three-dimensional image of hepatocellular carcinoma under confocal laser scanning microscope[J].World J Gastroenterol，2000，6（3）：344-347.

[5]Ma XD，Ma X，Sui YF，et al.Signal transduction of gap junctional genes， connexin32， connexin43 in human hepatocarcinogenesis[J].World J Gastroenterol，2003，9（5）：946-950.

編輯/孫杰