殺菌/滲透增強(qiáng)蛋白基因轉(zhuǎn)染小鼠受到大腸桿菌攻擊后結(jié)腸粘膜上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)的變化機(jī)制

摘要：目的 殺菌通透性增加蛋白嵌合基因（BPI700-Fcγ1700）轉(zhuǎn)染的小鼠，給予感染最小致死劑量（MLD）的大腸桿菌，觀察和探究結(jié)腸上皮電阻和離子轉(zhuǎn)運(yùn)的變化和機(jī)制。方法 利用基因轉(zhuǎn)染、短路電流記錄、ELISA測(cè)定技術(shù)，記錄轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)腸粘膜的基礎(chǔ)電流、電壓以及給予促分泌物對(duì)上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。結(jié)果 基因轉(zhuǎn)染小鼠與對(duì)照組相比，結(jié)腸上皮基礎(chǔ)電阻和短路電流明顯增加，在上皮的頂膜側(cè)加入鈉離子通道阻斷劑阿米洛利后，則可以明顯抑制增加的電阻；應(yīng)用上皮離子促分泌物forskolin后，可以明顯增加結(jié)腸上皮的短路電流，這種短路電流可以被氯離子通道阻斷劑DPC、Na+-K+-2Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑bumetanide明顯抑制；并且forskolin作用結(jié)腸粘膜后上皮cAMP的含量明顯高于對(duì)照組。結(jié)論 基因轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸上皮陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)明顯增加，從而促進(jìn)了腸道排毒反應(yīng)，這可能是轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)致死性大腸桿菌抵抗力增加的原因之一。本研究為革蘭氏陰性菌感染的研究和治療提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：殺菌/滲透增強(qiáng)蛋白；結(jié)腸；上皮；離子轉(zhuǎn)運(yùn)；短路電流

革蘭氏陰性菌感染可以導(dǎo)致嚴(yán)重的病理變化，其引起的敗血癥和休克導(dǎo)致死亡率逐年增加[1，2]。常規(guī)的抗生素、抗炎癥因子等治療手段由于耐藥、不能中和內(nèi)毒素等原因，在臨床上不能獲得滿意的療效。找到能夠中和內(nèi)毒素、殺菌效果顯著的藥物變的非常迫切。殺菌/滲透增強(qiáng)蛋白（BPI）在1978年首次被發(fā)現(xiàn)，BPI及其重組功能片段經(jīng)過(guò)臨床研究證實(shí)，具有殺滅細(xì)菌和中和內(nèi)毒素的功能，但是因?yàn)榘胨テ诙獭⑸锢枚鹊偷仍?，在臨床應(yīng)用上具有很大的限制。

鑒于以上情形，我們構(gòu)建了殺菌/滲透增強(qiáng)蛋白的一種功能片段--BPI700-Fcγ1700。發(fā)現(xiàn)其有較高的生物利用度，并且可以明顯增加對(duì)大腸桿菌感染的抵抗力，遭受感染的動(dòng)物存活率明顯增加，提示此種功能片段具有很好的潛在應(yīng)用價(jià)值。眾所周知，腸道組織容易遭受致病性大腸桿菌的侵襲，我們先期發(fā)現(xiàn)BPI700-Fcγ1700在腸道組織有廣泛表達(dá)[3，4]。那么在結(jié)腸上皮BPI700-Fcγ1700對(duì)離子轉(zhuǎn)運(yùn)有何影響？機(jī)制如何？為了回答這些問(wèn)題，我們對(duì)BPI700-Fcγ1700基因轉(zhuǎn)染小鼠進(jìn)行了大腸桿菌的感染，應(yīng)用短路電流記錄技術(shù)等方法，檢測(cè)結(jié)腸上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)與粘膜屏障的變化，探究其抗感染能力的機(jī)理，為革蘭氏陰性菌感染的預(yù)防和治療手段的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物 BALB /c雄性小鼠（6周齡， 15～20 g） 45只，隨機(jī)分組，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)許可，動(dòng)物在室溫條件下，正常晝夜更替的光照，24h食水供應(yīng)，直至試驗(yàn)之日。動(dòng)物來(lái)源于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物科學(xué)部，國(guó)家等級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)。

1.2 用于測(cè)量短路電流的組織制備 小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸粘膜標(biāo)本制備：用頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，迅速?gòu)闹蹦c淋巴結(jié)向上取約4cm遠(yuǎn)端結(jié)腸（該淋巴結(jié)通常位于直腸向上約3 cm處）。沿腸系膜縱向切開，用通有95%氧和5%二氧化碳的冰K-HS（Krebs-Henseleit）溶液將組織的粘膜面沖洗干凈，用頂端精細(xì)的鑷子，在解剖顯微鏡下，小心將粘膜下層﹑肌層和漿膜層與粘膜層鈍性分離，得到一薄層組織，包括上皮層和一些粘連的結(jié)締組織，大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸粘膜標(biāo)本即制備完成。

1.3 主要試劑 主要試劑：阿米洛利、forskolin、DPC均為Sigma化學(xué)公司（St. Louis，MO）產(chǎn)品，均溶于二甲基亞砜。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，溶劑不改變基本的電生理參數(shù)。

1.4 基因轉(zhuǎn)染鼠的制備 請(qǐng)參考我們先前發(fā)表的文獻(xiàn)[4，5]。

1.5 短路電流測(cè)定技術(shù) 本實(shí)驗(yàn)采用恒溫灌流裝置體外測(cè)量短路電流，將結(jié)腸粘膜標(biāo)本置于灌流裝置的Ussing小室中。跨粘膜電位差由一對(duì)電壓敏感電極測(cè)得，該電極前端插入U(xiǎn)ssing小室靠近組織的電極插孔中，后端連接到前置放大器，并與電壓鉗儀器連接，儀器的輸出連接到圖表記錄儀，記錄測(cè)量結(jié)果。測(cè)量前，將儀器調(diào)零，消除兩電壓電極的電位差和溶液的電阻。用電壓鉗將上皮固定在零電位，使組織短路，此時(shí)測(cè)得跨上皮電流為短路電流。每隔25s，自動(dòng)施以-0.1 mV的電壓脈沖（ΔVt）刺激，觀察膜電流變化（ΔIt），根據(jù)歐姆定律Rt=ΔVt/ΔIt， 計(jì)算膜電阻（Rt）。刺激前后跨膜電流的改變以粘膜單位面積通過(guò)的電流（μA*cm-2）為校準(zhǔn)，以電流面積（μA*min）的形式表現(xiàn)。

1.6 cAMP的測(cè)定 取遠(yuǎn)端結(jié)腸粘膜標(biāo)本，將其置于37℃通有5% CO2和95% O2的K-HS溶液中孵育；每樣品稱重約150 mg。在500 ml K-HS液中孵育平衡30 min后，以觀察藥物對(duì)胞內(nèi)cAMP水平變化的影響；經(jīng)藥物處理后，迅速將組織取出，在濾紙上吸取出多余水份，再置于液氮中迅速冷凍；測(cè)定時(shí)將組織在冰上勻漿后并離心 （10620×g， 5 min）。細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的測(cè)定由商業(yè)化的ELISA試劑盒完成（華英生物技術(shù)有限公司，北京，中國(guó)）

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，先測(cè)定結(jié)腸粘膜的基礎(chǔ)電壓（potential difference，PD）﹑跨膜電阻（transepithelial resistance，TR）以及基礎(chǔ)電流（basal current，BC），加藥后觀察ISC的變化，單位為μA*cm-2。應(yīng)用GraphPad Prism 4.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以\"均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)誤\" （means ± S.E.M.）表示。

2結(jié)果

2.1 結(jié)腸上皮基礎(chǔ)電生理學(xué)特征的測(cè)定 見圖1，BPI700-Fcγ1700 基因轉(zhuǎn)染組（gene-transferred），兩組對(duì)照鼠（PBS control和（EGFP control）都有基礎(chǔ)的跨膜電壓（PD） （見圖1A）， 電流（ISC） （見圖1B）， 以及電阻（Rt） （見圖1C）。轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出更高的PD （3.1 ± 0.3 mV， n=30， P<0.01 ）， ISC （81.3 ± 2.6 μA/cm2， n=30 P<0.01） 和Rt （38.6 ± 3.8 Ω·cm2， n=30， P<0.05）。

為了闡明轉(zhuǎn)基因小鼠基礎(chǔ)短路電流增加的機(jī)制，在結(jié)腸粘膜的頂膜側(cè)加入上皮鈉離子通道（ENaC）的阻斷劑阿米洛利（10 μM），結(jié)果表明基礎(chǔ)電流由81.3 ± 2 ？滋A/cm2 降到55.4 ± 2？滋A/cm2 （n = 9， P<0.01）；而兩個(gè)對(duì)照組則沒有明顯變化。結(jié)果提示ENaC參與了轉(zhuǎn)基因小鼠基礎(chǔ)電流的形成。

2.2 Forskolin對(duì)結(jié)腸粘膜的作用 為了比較轉(zhuǎn)基因鼠與對(duì)照組對(duì)促分泌物的影響有何差異，應(yīng)用forskolin （10 μM）觀察對(duì)結(jié)腸粘膜的作用。結(jié)果表明forskolin使轉(zhuǎn)基因組的短路電流水平由81.3 ± 2？滋A/cm2 增加到 175.4 ± 5？滋A/cm2 （n = 7， P<0.01），顯著高于對(duì)照組。應(yīng)用Cl-通道阻斷劑DPC可以明顯抑制 forskolin引起的短路電流，從175.4 ± 5 到 91 ± 3？滋A/cm2 （見圖2A， n = 7， P< 0.01） ， Na+-K+-2Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑bumetanide （100？滋M）也有類似作用（見圖2B）。

這些結(jié)果提示促分泌物更能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因鼠而不是對(duì)照組的陰離子分泌，這可能是轉(zhuǎn)基因鼠更有助于排除傷害性物質(zhì)的原因之一。

2.3 cAMP依賴性信號(hào)參與轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)腸上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn) 應(yīng)用ELISA方法測(cè)定結(jié)腸上皮cAMP的含量。轉(zhuǎn)基因鼠的基礎(chǔ)含量為106.3 ± 18 pmol·mg-1 ，對(duì)照組分別為112± 7.2pmol·mg-1 和100.3 ± 4.09 pmol·mg-1 （n = 6）。應(yīng)用forskolin后，轉(zhuǎn)基因組cAMP含量增加到 256.5 ± 17 pmol·mg-1 ；而對(duì)照組的變化明顯小于實(shí)驗(yàn)組。

3討論

我們先前發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)致死性大腸桿菌攻擊后，殺菌-滲透增強(qiáng)蛋白基因轉(zhuǎn)染小鼠的存活率明顯增高，但伴有腹瀉，其腸道粘膜的離子轉(zhuǎn)運(yùn)變化不明，機(jī)制不清。短路電流記錄技術(shù)逐步地應(yīng)用于胃腸道粘膜上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)的研究，我們應(yīng)用此種技術(shù)記錄不同組別小鼠的電生理學(xué)特征。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠有更大的基礎(chǔ)電阻、電流，并且在刺激物的作用下有更為明顯的促進(jìn)陰離子分泌的作用。

腸道上皮Cl-通道在水鹽代謝中扮演重要角色[6， 7]，其正常的離子轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)維持生理功能和穩(wěn)態(tài)不可或缺。在大量影響因子或者傷害性因素的侵襲下，轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)腸粘膜可以產(chǎn)生更大量的Cl-分泌以及電阻增加，從而促使血液或腸道上皮細(xì)胞中更多物質(zhì)排到腸腔中，減輕有毒物質(zhì)如細(xì)菌、病毒等對(duì)機(jī)體的傷害。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠被forskolin促分泌效應(yīng)刺激后，可以產(chǎn)生更多的cAMP，表明轉(zhuǎn)基因小鼠之所以表現(xiàn)電阻增加、更明顯的促陰離子分泌作用，是可能通過(guò)cAMP信號(hào)通路來(lái)完成的。

根據(jù)我們先前的研究結(jié)果以及結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[8]，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)促分泌物forskolin的刺激更為敏感，氯離子的分泌更為顯著，并且伴有上皮鈉離子通道ENaC活動(dòng)的增加。這些成為其抗感染能力增加的主要機(jī)理之一。

本實(shí)驗(yàn)第一次證實(shí)殺菌-滲透增強(qiáng)蛋白基因轉(zhuǎn)染小鼠能夠增加結(jié)腸上皮的電阻以及cAMP依賴性的離子轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增加粘膜屏障功能，促進(jìn)腸道毒素排除，改善受感染小鼠的存活率。本研究為革蘭氏陰性菌感染的預(yù)防和治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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編輯/王海靜