lncRNA在畜禽遺傳育種中的研究進(jìn)展及應(yīng)用展望

摘要長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200 nt的RNA分子，它們不編碼蛋白，而是以RNA的形式在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)。對(duì)lncRNA在畜禽遺傳育種中的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對(duì)lncRNA在畜禽育種中的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞lncRNA；畜禽；育種

中圖分類號(hào)S813.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）29-10152-03

基金項(xiàng)目中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014M552004）。

作者簡(jiǎn)介朱金龍（1986- ），男，河南許昌人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事畜禽遺傳育種方面的研究。*通訊作者，講師，博士，從事生物技術(shù)與家禽育種研究。

1畜禽育種現(xiàn)狀

近半個(gè)世紀(jì)以來，隨著畜禽遺傳改良和飼料營(yíng)養(yǎng)等研究技術(shù)的不斷進(jìn)步，畜牧業(yè)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，畜禽生長(zhǎng)速度的加快和飼料轉(zhuǎn)化率的提高使得畜禽產(chǎn)品產(chǎn)量越來越高。然而，隨著人民生活水平的逐步提高，消費(fèi)者對(duì)畜禽畜產(chǎn)品的需求不僅再停留在數(shù)量上，而對(duì)畜禽產(chǎn)品的感觀、嫩度和風(fēng)味等提出了更高的要求。目前，人們對(duì)肉品質(zhì)的期望與畜禽肉品質(zhì)的下降之間矛盾，已成為廣大畜禽育種工作者亟待解決的實(shí)際問題之一。因此，針對(duì)畜禽肉品質(zhì)的研究已成為畜禽育種工作者所重點(diǎn)關(guān)注的課題和畜牧科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

畜禽肉品質(zhì)是一個(gè)綜合性概念，包含滋味、嫩度及色澤等因素。肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat，IMF）的含量與肉的嫩度呈正相關(guān)，是影響肉的風(fēng)味、色澤和系水力等肉品質(zhì)的重要因素，也是畜產(chǎn)品肌肉品質(zhì)選育的有效指標(biāo)[1]。IMF是指分布于肌肉組織中肌纖維間的脂肪，主要分布于肌外膜、肌束膜以及肌內(nèi)膜上。IMF含量的增加可以降低肌肉的剪切力，進(jìn)而提高肉的嫩度，使肌肉柔軟多汁。脂肪細(xì)胞的分化與脂類代謝在IMF沉積過程中起著重要作用，涉及到分化轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)和脂質(zhì)代謝調(diào)控基因的時(shí)序表達(dá)等一系列變化[2-3]。轉(zhuǎn)錄因子的活性受到多種胞內(nèi)外因子及信號(hào)通路的調(diào)控，它們的啟動(dòng)對(duì)前體脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞起決定作用。

近來年，遺傳育種學(xué)家通過分子育種和轉(zhuǎn)基因等現(xiàn)代生物技術(shù)，開展了畜禽新品種（系）選育，重點(diǎn)開展了畜禽生長(zhǎng)速度與肉品質(zhì)性狀的選擇，在某種程度上改善了畜禽的生產(chǎn)性能。然而，對(duì)于一個(gè)生物性狀而言，它不僅受DNA水平基因的控制，而且還受mRNA水平轉(zhuǎn)錄前后的調(diào)控，且這個(gè)水平的調(diào)控更為全面、系統(tǒng)和精確。因此，如何研究發(fā)掘畜禽肌內(nèi)脂肪生成的分子機(jī)制，用于指導(dǎo)目前畜禽育種工作，這已成為現(xiàn)代生物技術(shù)背景下畜禽育種的緊迫且關(guān)鍵任務(wù)。

2lncRNA的研究現(xiàn)狀

對(duì)“DNA元件百科全書”計(jì)劃的研究表明，人類基因組中有93%的DNA能被轉(zhuǎn)錄成RNA，且大多為非編碼RNA。2012年9月，該項(xiàng)目獲得了最詳細(xì)的人類基因組分析數(shù)據(jù)，證實(shí)80%的基因組以非編碼RNA形式在控制細(xì)胞、組織和器官的行為，且發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。這些非編碼RNA中，除了tRNA、rRNA等為人熟知外，其余大量的非編碼RNA一直被人們誤認(rèn)為“垃圾序列”而未受重視。根據(jù)其長(zhǎng)度，非編碼RNA可分為短鏈非編碼RNA（miRNA、siRNA和piRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）。lncRNA是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200 nt的RNA分子，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，其中絕大多數(shù)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄并經(jīng)可變剪接而來，根據(jù)其在基因組中的相對(duì)位置可將其分為正義 lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、基因內(nèi)lncRNA和基因間lncRNA等5類。

長(zhǎng)非編碼RNA（Iong non-coding RNA，lncRNA）在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因表達(dá)扮演著極其重要的調(diào)控角色。lncRNA參與表觀遺傳修飾[4]、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后等多水平的調(diào)控過程[5]。目前，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在細(xì)胞分化與增殖、生長(zhǎng)發(fā)育[6]、器官生成[7]、免疫應(yīng)答及腫瘤發(fā)生[8]等多個(gè)生命過程中均扮演著關(guān)鍵的角色。它的發(fā)現(xiàn)使人類對(duì)編碼RNA的認(rèn)識(shí)揭開了新的篇章，認(rèn)識(shí)到動(dòng)物細(xì)胞基因調(diào)控的一種新途徑，補(bǔ)充了在RNA水平對(duì)靶mRNA分子進(jìn)行更迅速和有效調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)，展現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控全方位多層次的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。

近年來，全球科學(xué)家對(duì)人類基因組中l(wèi)ncRNA的調(diào)控作用開展了較大規(guī)模的研究，并取得了一些突破性進(jìn)展，lncRNA相關(guān)報(bào)道如同雨后春筍般涌現(xiàn)，人們對(duì)于lncRNA的調(diào)控角色有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。與miRNA相比，lncRNA在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄比例更高，具有復(fù)雜而重要的生物學(xué)功能，并與復(fù)雜的生物性狀密切相關(guān)。大多數(shù)lncRNA在生物發(fā)育的某些階段產(chǎn)生，具有組織或細(xì)胞特異性，其功能涉及到胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的增殖分化、器官發(fā)生、劑量補(bǔ)償、表觀遺傳調(diào)控和基因印記等生命活動(dòng)中。

lncRNA主要通過以下3個(gè)層面實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控：①表觀遺傳水平：通過介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾來調(diào)控下游基因的表達(dá)；②轉(zhuǎn)錄水平：與上游啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，干擾下游基因的表達(dá)；③轉(zhuǎn)錄后水平：通過與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切或者生成內(nèi)源性siRNA來調(diào)控基因的表達(dá)（見圖1）[9-10]。

注：A.lncRNA 能介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)或?qū)ζ溥M(jìn)行組蛋白修飾，從而促使異染色質(zhì)的形成，抑制基因的表達(dá)；B.lncRNA 可通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程；C.lncRNA 可作為轉(zhuǎn)錄因子的共激活因子調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄；D.lncRNA可形成3 聚體復(fù)合物而干擾啟動(dòng)子的作用，從而使基因表達(dá)沉默；E.反義lncRNA 能和鋅指同源盒mRNA 的5’剪切位點(diǎn)結(jié)合，防止內(nèi)含子被剪切。

在 3 個(gè)層面上實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控[10]現(xiàn)有研究表明，lncRNA具體的作用方式包括：①在編碼蛋白基因的上游啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄，從而干擾鄰近蛋白編碼基因的表達(dá)（如酵母中的SER3基因）；②抑制RNA聚合酶，或介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白修飾，而影響基因表達(dá)；③與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，進(jìn)而干擾mRNA的剪切，產(chǎn)生不同的剪切形式；④與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶作用下產(chǎn)生內(nèi)源性的siRNA（小干擾RNA），調(diào)控基因的表達(dá)水平；⑤結(jié)合在特定蛋白質(zhì)上調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；⑥作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì) 形成 核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；⑦結(jié)合在 特定蛋白上從而改變?cè)摰鞍椎陌|(zhì)定位；⑧可作為小分子RNA（如miRNA、piRNA、mascRNA）的前體分子。

此外，lncRNA與miRNA還存在互作關(guān)系，lncRNA既可以是miRNA的前體分子[11]，miRNA又可以調(diào)控lncRNA的轉(zhuǎn)錄和生成[12]。lncRNA可以誘餌的方式吸附一些特定的miRNA，影響miRNA靶基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能，具備該作用的lncRNA也被稱為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源的RNA（Competing endogenous RNA，ceRNA）[13]。Gong等發(fā)現(xiàn)1種稱為半Stau1結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA （Half-Stau1- binding site RNA，1/2-sbsRNA） 通過與mRNA的3’UTR的Alu元件的不完全配對(duì)，形成Stau1結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)Stau1與mRNA結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解[14-15]。

2.1lncRNA在肌肉發(fā)育過程中的作用目前，關(guān)于lncRNA調(diào)控肌肉發(fā)育的相關(guān)研究報(bào)道很少。Sunwoo等[16]在研究C2C12成肌細(xì)胞在分化成肌管的過程中，發(fā)現(xiàn)2個(gè)顯著上調(diào)的lncRNA：Men epsilon和Men beta，敲除這2個(gè)lncRNA會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)RNA和蛋白的復(fù)合體的解離，表明它們是細(xì)胞核內(nèi)RNA和蛋白的復(fù)合體必須組成部分，然后共同調(diào)控成肌細(xì)胞向成肌管分化。Cesana等[17]發(fā)現(xiàn)1個(gè)lncRNA（linc-MD1）可分別與miR-135及miR-133特異性結(jié)合，進(jìn)而保證這二者的靶基因，即肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C（MEF2C）及決定因子樣蛋白-1（MAML1）的表達(dá)，由此對(duì)成肌纖維細(xì)胞分化產(chǎn)生顯著影響。Cabianca 等[18]發(fā)現(xiàn)1個(gè)lncRNA（DBE-T）募集蛋白Ash1L啟動(dòng)組蛋白H3第36位的賴氨酸發(fā)生二甲基化使染色體發(fā)生重塑，從而導(dǎo)致肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的發(fā)生。這表明肌肉發(fā)育過程中均有l(wèi)ncRNA參與，并扮演著關(guān)鍵的角色。

2.2lncRNA在脂肪代謝中的調(diào)控作用Ramayo等[19]對(duì)豬的組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，在高肌內(nèi)脂肪酸組織中鑒定了270個(gè)lncRNA，而低肌內(nèi)脂肪酸組織中鑒定了186個(gè)lncRNA，表明有l(wèi)ncRNA參與肌內(nèi)脂肪酸形成并起著重要作用。Sun等[20]研究表明lncRNA能夠調(diào)控脂肪形成，并鑒定了175個(gè)脂肪代謝相關(guān)的lncRNA，基因組信息分析發(fā)現(xiàn)23（13%）個(gè)上調(diào)表達(dá)的lncRNA啟動(dòng)子區(qū)含PPARγ結(jié)合位點(diǎn)，34（19%）個(gè)表達(dá)上調(diào)的lncRNA上游含CEBPα結(jié)合位點(diǎn)。通過RNAi來抑制10個(gè)lncRNA的表達(dá)會(huì)阻斷脂肪的形成。Pang等[21]發(fā)現(xiàn)PU.1基因的mRNA在前體脂肪細(xì)胞中高表達(dá)，但Western blot試驗(yàn)證明其蛋白在前體脂肪細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，PU.1 AS lncRNA與PU.1 mRNA形成mRNA/AS lncRNA復(fù)合物，從而阻止PU.1 mRNA的翻譯，敲低PU.1 AS lncRNA能增加PU.1 mRNA的水平，促進(jìn)其翻譯，抑制脂聯(lián)素等脂肪因子的釋放，進(jìn)而阻礙脂肪細(xì)胞分化。Zhang等[22]鑒定了人棕色脂肪組織中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)704個(gè)上調(diào)和896個(gè)下調(diào)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)AK003288通過調(diào)控Jph基因來影響脂肪代謝。由此可見，lncRNA在脂肪組織的形成、分化和代謝等過程中發(fā)揮著重要的作用，lncRNA的研究已成為分子生物學(xué)研究的新熱點(diǎn)。

3lncRNA在畜禽育種中的應(yīng)用及展望

目前，lncRNA在畜禽育種中的研究報(bào)道甚少，僅有的一些研究相對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也比較落后，畜禽育種中關(guān)于lncRNA的研究主要集中在lncRNA的發(fā)現(xiàn)與特征分析。Zhang等[22]利用測(cè)序和芯片技術(shù)分析了lncRNA在棕色脂肪組織和骨骼肌組織的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA調(diào)控棕色脂肪細(xì)胞與骨骼肌細(xì)胞之間的分化。Huang等[23]利用牛EST數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定了449個(gè)潛在的lncRNA，并對(duì)它們進(jìn)行了序列特征分析，結(jié)果表明這些lncRNA具有組織表達(dá)特異性，GC含量低于蛋白編碼基因。Weikard等[24]通過對(duì)有色素沉著和無(wú)色素沉著的不同牛個(gè)體皮膚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了10 884個(gè)未知轉(zhuǎn)錄本，4 848個(gè)經(jīng)預(yù)測(cè)具有l(wèi)ncRNA特征，其中絕大多數(shù)（4 365個(gè)）為基因間lncRNA。IGF2R為母系印跡基因，在胚胎發(fā)育中具有重要作用，其表達(dá)與1種lncRNA Airn的表達(dá)量呈正相關(guān)。Farmer等[25]研究表明在牛上也存在Airn基因，其在胚胎期的表達(dá)量逐漸增加。Rocha等利用新一代轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序技術(shù)在牛上也發(fā)現(xiàn)了一些lncRNA。相對(duì)于lncRNA在家畜育種中的研究，lncRNA在畜禽中的研究報(bào)道更是屈指可數(shù)。Li等[26]利用深度測(cè)序技術(shù)鑒定雞骨骼肌中281個(gè)lncRNA，其保守性高于其他隨機(jī)的非編碼序列。綜上所述，目前關(guān)于動(dòng)物肌肉、脂肪相關(guān)lncRNA及其對(duì)靶基因的調(diào)控研究還十分欠缺，尤其是關(guān)于lncRNA在畜禽肌肉、脂肪生長(zhǎng)發(fā)育中的研究尚未見報(bào)道。因此，系統(tǒng)地分離克隆鑒定并從功能上研究畜禽肌肉、脂肪生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)lncRNAs，探究其調(diào)控的分子機(jī)制已十分必要。

目前，關(guān)于lncRNA在畜禽主要經(jīng)濟(jì)性狀方面的研究正剛剛起步，其功能與調(diào)控機(jī)制也有待深入研究。系統(tǒng)地分離篩選與肌內(nèi)脂肪生成相關(guān)lncRNA，并探究其在地方畜禽品種的優(yōu)異肉質(zhì)性狀形成過程中的分子機(jī)制已十分必要和緊迫。在lncRNA-seq測(cè)序和生物信息分析篩選的肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)lncRNA等研究基礎(chǔ)上，探究lncRNA在不同階段各組織中表達(dá)變化規(guī)律，進(jìn)一步篩選與肌內(nèi)脂肪沉積規(guī)律相關(guān)的lncRNA；利用功能獲得和功能缺失策略，從細(xì)胞水平確定對(duì)前體脂肪細(xì)胞增殖與分化有顯著差異的關(guān)鍵lncRNA，揭示lncRNA對(duì)畜禽脂肪細(xì)胞增殖與分化的生物學(xué)效應(yīng)；然后，克隆關(guān)鍵lncRNA全長(zhǎng)，利用ChIRP技術(shù)分離其靶基因，并利用RNAi試驗(yàn)對(duì)靶基因進(jìn)行驗(yàn)證，闡明lncRNA在畜禽肌內(nèi)脂肪生成過程中的分子調(diào)控機(jī)制，這對(duì)闡明重要生命現(xiàn)象的分子機(jī)理具有重要科學(xué)意義以及對(duì)畜禽肉品質(zhì)的提高具有現(xiàn)實(shí)意義，并可為培育肉質(zhì)優(yōu)異的地方畜禽新品系提供理論依據(jù)和新的思路。

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