茶樹組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

摘要 從茶樹外植體的選取、表面滅菌、培養(yǎng)基的確定及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的確定等方面對茶樹組織培養(yǎng)技術(shù)體系的研究進(jìn)行綜述，指出目前研究中存在的問題，并對今后的研究進(jìn)行了展望，為進(jìn)一步開展茶樹組織培養(yǎng)研究提供參考。

關(guān)鍵詞 茶樹；組織培養(yǎng)；滅菌；培養(yǎng)基

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10086-02

基金項(xiàng)目湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目（2011620005003-04）。

作者簡介曹丹（1988-），女，河南開封人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事茶資源與育種研究。*通訊作者。

茶樹[Camellia sinensis （L.） O. Kuntze]屬于山茶科山茶屬茶組，是多年生常綠異花授粉木本植物。其葉經(jīng)過加工后的飲品是世界上三大消費(fèi)量最大的飲料之一，具有營養(yǎng)價(jià)值和保健功效[1]。

組織培養(yǎng)技術(shù)既可用于大量生產(chǎn)優(yōu)良無性系植株，又可打破種屬間的界限，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和等障礙，對于開展茶樹種質(zhì)資源的保存、新品種的培育及種性改良等方面的研究具有重要意義。茶樹組織培養(yǎng)技術(shù)的研究于20世紀(jì)60年代開始，英國劍橋大學(xué)以茶樹幼嫩莖段為材料研究離體咖啡堿的合成[2]，目前已在次級代謝的研究、次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)、茶苗的繁殖、誘導(dǎo)單倍體植株和種質(zhì)資源的保存等方面取得了較多的成果。筆者就目前國內(nèi)外茶樹組織培養(yǎng)現(xiàn)狀及問題進(jìn)行綜述，旨在為研究和優(yōu)化茶樹組織培養(yǎng)技術(shù)，對茶樹育種及良種繁育等方面的研究提供參考。

1研究現(xiàn)狀

1.1外植體的選取外植體的選擇對組織培養(yǎng)技術(shù)至關(guān)重要。目前，茶樹已經(jīng)成功地從莖尖[3-4]、莖段[5-9]、腋芽[10-12]、子葉[13-14]、葉片[15-16]、胚[17-19]、下胚軸[20]和花藥[21]等成熟或未成熟組織中通過愈傷組織或者直接產(chǎn)生不定芽的方式進(jìn)行器官發(fā)生和植株再生。外植體供體植株間的差異也將影響外植體的生理狀態(tài)，進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)生。一般而言，較小的外植體再生能力較弱，而大的則強(qiáng)。此外，多數(shù)研究者傾向于采用春季新梢及冬季催芽萌發(fā)的嫩莖作為芽和莖的材料，且室內(nèi)控制條件下培養(yǎng)的實(shí)生苗和組培苗比田間生長的茶樹污染輕，消毒處理也較方便，是組織和器官培養(yǎng)較好的材料來源[22]。

1.2外植體的滅菌外植體的滅菌是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟。接種前應(yīng)對外植體進(jìn)行徹底的表面消毒和深度滅菌[23]，外植體消毒的常用方法有用洗衣粉清理表面、自來水沖洗、置超凈工作臺、75%乙醇消毒處理、消毒劑處理（常用的消毒劑有次氯酸鈉、升汞等）及無菌水沖洗等。

譚和平等[24]以茶樹腋芽為外植體，先用水沖洗干凈，70%乙醇浸15～30 s，再用0.1%的氯化汞溶液消毒8～12 min，無菌水洗5次。易鑫等[25]采用正交試驗(yàn)研究茶樹外植體的最佳消毒方式，結(jié)果表明，在適量的洗衣粉溶液中洗滌5 min后，置于自來水下沖洗2 h。將外植體用75%的乙醇溶液浸泡30 s，再用0.1%的氯化汞滅菌，當(dāng)把滅菌時間設(shè)定為8 min時，滅菌效果最好。

1.3培養(yǎng)基的確定在茶樹組織培養(yǎng)中，常將MS作為基本培養(yǎng)基。張婭婷等[8]以MS、White和N6為基本培養(yǎng)基，附加等量的維生素、氨基酸、糖和植物生長調(diào)節(jié)劑，對藪北茶芽苗進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MS基本培養(yǎng)基效果優(yōu)于White和N6基本培養(yǎng)基。楊國偉等[26]研究發(fā)現(xiàn)，MS比White、Heller培養(yǎng)基更有利于茶樹愈傷組織的生長，茶樹愈傷組織在MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率高達(dá)90%。Haldeman也比較了MS與Anderson’s Rhodo dendron培養(yǎng)基對茶樹愈傷組織培養(yǎng)的效果，結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基效果最佳。

研究表明，基本培養(yǎng)基中大量元素的含量對茶樹組織培養(yǎng)影響很大，成浩等[27]發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基大量元素降為原來的1/2，不僅可以促進(jìn)莖段的誘導(dǎo)和生長，也可以降低莖段的褐化率。但在實(shí)際操作中，大多數(shù)研究者分別采用全量的大量元素進(jìn)行誘導(dǎo)與增殖，采用半量的大量元素進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.4生長調(diào)節(jié)劑的確定生長調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，其種類與配比是外植體能否成功啟動的關(guān)鍵因素之一。因器官不同，其激素水平存在差異，且對外源性的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的敏感性也不同，故不同品種及不同類型的外植體對不同生長調(diào)節(jié)劑的種類和配比反應(yīng)也不同。在快速繁殖時，通常生長素含量應(yīng)稍低，這是因?yàn)樯L素含量過高易導(dǎo)致愈傷組織的形成，而愈傷組織的形成會降低增殖率。此外，細(xì)胞分裂素含量高時將會阻礙愈傷組織的形成，而有利于芽的誘導(dǎo)和生長。劉德華等[28]、李家華等[29]和張建華等[30]在沒有添加BA的情況下，無叢生芽長出，而在添加高濃度BA的情況下長出了叢生芽。在生根培養(yǎng)中，一般認(rèn)為先對外植體進(jìn)行預(yù)處理，再轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基有利于提高其生根率，一般采用IBA進(jìn)行預(yù)處理，但生根率不受IBA預(yù)處理時間的影響，而主要受IBA濃度的影響[27]。

1.5其他茶樹組織培養(yǎng)除與培養(yǎng)基與生長調(diào)節(jié)劑等相關(guān)外，還與培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。劉德華等[31]研究發(fā)現(xiàn)，子葉片隆起發(fā)生率在一定程度內(nèi)與光照強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)，子葉胚的胚狀體和不定芽分化率在一定程度內(nèi)與光照強(qiáng)度呈正相關(guān)。鐘俊輝等[32]研究發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)茶氨酸累積和茶細(xì)胞生長的最佳溫度是25 ℃，而在32 ℃或35 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，愈傷組織將會褐變，甚至枯死，且暗培養(yǎng)比光培養(yǎng)更能促進(jìn)茶氨酸的聚集。

2存在問題與措施

從20世紀(jì)初開始，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已成功應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和醫(yī)藥業(yè)等領(lǐng)域，并產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。褐化、污染和玻璃化是植物組織培養(yǎng)公認(rèn)的三大難題[33-34]。茶樹因多酚含量高，且自身攜帶較多內(nèi)生菌，在試驗(yàn)過程中會出現(xiàn)外植體、污染等問題。

2.1外植體褐化茶樹中的酚類物質(zhì)含量較高，而進(jìn)行組織培養(yǎng)時，由于外植體要進(jìn)行切割造成傷口，使得多酚類物質(zhì)與底物多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的隔離被打破，遇到氧氣發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生褐色物質(zhì)，褐色物質(zhì)逐漸擴(kuò)散到整個培養(yǎng)基，最終造成外植體褐變[35]。此外，外植體褐變還與外植體部位、取樣時間、培養(yǎng)基成分和消毒方式等因素有關(guān)。黃燕芬等[36]探討了外植體的滅菌時間、激素比例、取樣方式及外源物質(zhì)等因素在茶樹組織培養(yǎng)過程中對外植體褐化程度的影響，結(jié)果表明，外植體用0.1%的升汞表面消毒7～8 min，接種外植體帶腋芽葉片保留2/5，每隔3 d進(jìn)行一次轉(zhuǎn)瓶，培養(yǎng)基中添加1.0 g/L Vc和1.0 g/L吸附劑AC，能將外植體的褐化率降至41%。

減少外植體的褐化，主要從以下幾個方面著手：①選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w。從生長健壯的植株上選取發(fā)育正常的部位作為外植體，在組織培養(yǎng)過程中不易發(fā)生褐變，在取樣時還需注重基因型的選擇，可以將不易發(fā)生褐變的品種作為外植體。②吸附劑與抑制劑的使用。在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑及其他抑制劑能有效減輕外植體在組織培養(yǎng)過程中的酶促褐變，如在培養(yǎng)基中加入多羥基還原物質(zhì)Vc，另外，可作為抑制劑的物質(zhì)如氰化鉀、氨基酸、蛋白水解產(chǎn)物、多胺等都可用來防止褐變現(xiàn)象。此外，活性炭吸附性強(qiáng)，可以用來吸附培養(yǎng)基中的醌和酚等有害物質(zhì)，減輕褐變，同時培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)也將被吸附，故在培養(yǎng)基中加入活性炭時也需注意不同激素間的配比，在防止褐變的同時能保證外植體的正常發(fā)育。③及時轉(zhuǎn)瓶。接種后，每隔3～5 d轉(zhuǎn)瓶一次，可有效減少酚類物質(zhì)在培養(yǎng)基中的富集，有效減輕褐變。④改善培養(yǎng)條件。接種后先在低溫或者黑暗中預(yù)陪養(yǎng)幾天可降低褐化程度。

2.2外植體污染外植體污染是植物組織培養(yǎng)中普遍存在的問題。茶樹組織培養(yǎng)分為一般性污染和內(nèi)源性污染。一般性污染是針對不同類型外植體選擇的消毒劑不當(dāng)，導(dǎo)致材料消毒不徹底或是實(shí)驗(yàn)人員在操作過程中未嚴(yán)格按照要求進(jìn)行操作從而導(dǎo)致的污染。一般性污染可采取一定措施盡量降低或避免。而內(nèi)源性污染是茶樹自身攜帶的內(nèi)生菌引起的，且茶樹內(nèi)生菌含量較豐富，在對其進(jìn)行組織培養(yǎng)時極易發(fā)生內(nèi)生菌污染，其防治十分困難。

目前有關(guān)防治茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的報(bào)道較少，故今后應(yīng)深入開展這方面的研究。

3展望

茶樹組織培養(yǎng)技術(shù)雖然在多方面取得了較大成就，但在基礎(chǔ)研究方面以及進(jìn)一步優(yōu)化次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)條件、利用組培技術(shù)快速大量繁殖茶樹種質(zhì)資源、提高茶樹組織培養(yǎng)的再生頻率等方面的研究還需繼續(xù)加強(qiáng)。另外，由于茶樹離體再生較困難且轉(zhuǎn)化效率極低[37]，雖然目前在對茶樹遺傳轉(zhuǎn)化的探索較多，但突破性的進(jìn)展較少，故應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)方面的研究。

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