響應(yīng)面法優(yōu)化甘麥大棗湯的提取工藝

摘要[目的]優(yōu)化甘麥大棗湯的提取工藝。[方法]選擇溶媒用量、浸泡時間、煎煮時間、提取溫度4個影響中藥提取率的因素進(jìn)行單因素試驗，在此基礎(chǔ)上選取料液比、提取時間和提取溫度3個主要因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，得出最佳工藝條件。[結(jié)果]該研究確定的最佳提取條件為料液比15.79∶1、提取時間80 min、提取溫度60 ℃，預(yù)測黃酮提取率最大，為0.108 5%。[結(jié)論]該研究理論值與實測值相吻合，所確定的工藝條件可以指導(dǎo)甘麥大棗湯的提取。

關(guān)鍵詞甘麥大棗湯；總黃酮含量；提取率；響應(yīng)面分析法

中圖分類號S567文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10142-04

作者簡介候深東（1990- ），男，山東陵縣人，碩士研究生，研究方向：海洋藥物。*通訊作者，教授，碩士生導(dǎo)師，從事海洋藥物開發(fā)與利用研究。

甘麥大棗湯出自漢代張仲景的《金匱要略》，是我國中藥經(jīng)典名方，具有養(yǎng)心安神、健脾寧心、和中緩急等功效。目前研究主要集中在該中藥處方及其加味的藥效學(xué)方面，尤其在抗抑郁方面研究較多[1-3]，而在其提取工藝方面研究較少。

響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）是一種利用合理的試驗設(shè)計方法，并通過試驗得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法[4-5]。它具有試驗周期短、精密度高、交互作用分析簡單等特點，廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[6-7]。該研究選擇總黃酮為優(yōu)化指標(biāo)[8-10]，在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了甘麥大棗湯的提取工藝，為該實驗室后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試藥炙甘草、大棗、浮小麥（所需中藥材均購自于同仁堂藥店），蘆丁對照品（aladdin試劑，批號C1424058）。

1.2儀器中藥粉碎機(jī)（DFY400，溫嶺市林大機(jī)械有限公司）、水浴鍋（HWS12型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、低速離心機(jī)（TD5K，長沙東旺實驗儀器有限公司）、紫外分光光度計（UV1100，上海美普達(dá)儀器有限公司）、電子天平（BSA323S，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）、100 ml容量瓶、25 ml容量瓶。

1.3試驗方法

1.3.1甘麥大棗湯的制備及試驗設(shè)計。

1.3.1.1制備。取烘干并冷卻至常溫的炙甘草、大棗，粉碎，過50目篩備用，然后精密量取炙甘草10 g、大棗15 g、浮小麥30 g混合，在不同影響因素條件下，經(jīng)水提法進(jìn)行提取，各提取液在4 000 r/min條件下離心15 min 取上清液，即得不同提取條件下的甘麥大棗湯，按體積比1∶1比例加入乙醚進(jìn)行脫色，脫色后的甘麥大棗湯4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2試驗設(shè)計。為了考察各影響因素對中藥組方提取率的影響程度，該研究對各影響因素進(jìn)行單因素分析，并根據(jù)試驗結(jié)果選擇影響甘麥大棗湯提取率的3個主要因素進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面分析，并大致估計響應(yīng)面設(shè)計試驗的中心試驗點和各因素額取值范圍。

1.3.2總黃酮含量測定方法的建立。黃酮類化合物是色原烷或色原酮的衍生物，其基本骨架具有如圖1所示的C6C3C6結(jié)構(gòu)。黃酮母核中含有堿性氧原子，一般又多帶酚羥基，能和鋁離子產(chǎn)生黃色絡(luò)合物，又加入亞硝酸鈉和氫氧化鈉，使在堿性溶液中呈紅色，溶液在510 nm 處有最大吸收，顯色反應(yīng)在60 min 內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的蘆丁對照品適量，置 100 ml容量瓶中，加水并定容至刻度，搖勻，得濃度為 0.1 mg/ml的蘆丁對照品溶液，備用。

1.3.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密量取蘆丁對照品溶液 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 ml，分別置于 25 ml 容量瓶中，并加水至 12.0 ml，加 5%NaNO2溶液 1 ml，搖勻后靜置 6 min，加 10% Al（NO3）3溶液 1 ml，搖勻后靜置 6 min，加入 4% NaOH 溶液 10 ml，再加水定容至刻度，搖勻后再靜置 15 min，以無蘆丁對照品溶液的陰性試劑為空白，分別在 510 nm 波長處測定吸光度，以吸光度（A）為橫坐標(biāo)、溶液的濃度（C）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程（圖2）。

1.3.2.3樣品溶液總黃酮含量測定。按“1.3.1”制備甘麥大棗湯提取液，精密量取6 ml，置于 25 ml容量瓶中，按照上述方法進(jìn)行操作，在 510 nm 波長處測定吸光度，根據(jù)線性回歸方程計算樣品中總黃酮含量。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1溶媒用量對甘麥大棗湯提取率的影響。由圖3可知，當(dāng)料液比<14∶1時，總黃酮的提取率隨溶劑的增加而增加，其原因可能是隨溶劑的增加，溶劑和藥材溶度比變大，黃酮的擴(kuò)散速度加快，在溶劑中含量增加；當(dāng)料液比>14∶1時，總黃酮的提取量趨于穩(wěn)定，其原因可能是受藥材中黃酮含量的影響而不再增加。

2.1.2浸泡時間對甘麥大棗湯提取率的影響。由圖4可知，浸泡時間對黃酮的提取率影響較小，一定提取溫度下，黃酮的提取率在0.08%左右，并沒有明顯變化，可見浸泡時間不是影響提取率的主要因素。

2.1.3提取時間對甘麥大棗湯提取率的影響。由圖5 可知，黃酮的提取率在提取時間為20～40 min變化時，黃酮的提取率不斷增加，在提取40 min后，黃酮的提取率隨提取時間的延長，提取率趨于穩(wěn)定，在試驗提取溫度下，黃酮提取率維持在0.1%左右。

2.1.4提取溫度對甘麥大棗湯提取率的影響。由圖6可知，在提取溫度未達(dá)80 ℃時，黃酮的提取率隨提取溫度的升高而增加，其原因可能是因為隨溫度的升高，黃酮類物質(zhì)在溶劑中的擴(kuò)散速度和溶解度增加所致，提取溫度超高80 ℃時，黃酮的提取率反而有所減少，其原因可能是溫度升高使部分黃酮類物質(zhì)分解和溶劑揮發(fā)，導(dǎo)致黃酮在溶劑中的含量減少。

2.2響應(yīng)面分析法試驗設(shè)計

2.2.1響應(yīng)面試驗因素水平和中心組合試驗設(shè)計。從單因素試驗結(jié)果可以看出，各因素對提取率的影響順序依次為 溶媒用量>提取時間>提取溫度>浸泡時間；因此選擇料液比、提取時間、提取溫度3個影響因素，根據(jù)BoxBehnken中心組合試驗原理[11-12]，進(jìn)行試驗因素及水平設(shè)計（表1）。

根據(jù)表1 確定的因素水平，各組藥材浸泡30 min，按條件進(jìn)行提取，以總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值（Response），借助軟件Design-Expert 8.0.6.1 Trial進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。從表2可以看出，該試驗設(shè)計共需要做17個試驗，其中包含12個析因試驗和5個中心試驗，其中由3個影響因素所構(gòu)成的三維立體圖形的頂點為析因點，三維圖形的中心區(qū)域為零點，中心試驗要重復(fù)5次，以估計試驗誤差。

2.2.3響應(yīng)面圖形解析。根據(jù)“2.2.2”得出的回歸方程，做出3個影響因素之間的響應(yīng)面圖，預(yù)測3個影響因素對中藥浸膏得率的影響。由圖7a1、b1可知，料液比和提取時間對黃酮提取率的交互影響作用并不明顯，由立體圖可以看出，隨料液比的增加，黃酮提取率不斷上升，黃酮提取率隨提取時間變化不大，由等高線圖可以看出料液比對黃酮提取率的影響更為敏感；料液比和提取溫度的交互作用較為顯著，從立體圖（圖7a2）可以看出，隨料液比增高，黃酮提取率呈不斷增加趨勢，黃酮提取率隨提取溫度的不斷升高，呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，從等高線圖（圖7b2）可以看出料液比大于提取溫度對黃酮提取率的影響；提取時間和提取溫度的交互作用極顯著，從立體圖（圖7a3）可以看出，當(dāng)提取溫度較低時，黃酮提取率隨提取時間的增加而增加，當(dāng)提取溫度較高時，黃酮提取率隨提取時間的增加而減少，由等高線圖（圖7b3）可以看出，提取溫度略大于提取時間對黃酮提取率的影響。

根據(jù)上述確立的響應(yīng)面模型，通過DesignExpert 8.0.6.1軟件得出甘麥大棗湯最優(yōu)提取條件為料液比為15.79∶1、提取時間80 min、提取溫度60 ℃，預(yù)測黃酮提取率最大，為0.108 5%。為驗證此試驗確立的最佳工藝條件[15]，在上述條件下，做3次平行試驗，得到黃酮提取率為（0.107 2±0.001 6）%，與預(yù)測值相比低了1.198%，說明該研究優(yōu)化的工藝條件可靠。

3結(jié)論

該研究通過單因素試驗對影響中藥湯劑提取率的4個因素進(jìn)行了考察，得出料液比、提取時間、提取溫度對黃酮提取率影響較大，通過響應(yīng)面統(tǒng)計分析得出，黃酮的提取率有97.47%的可能是由這3個因素決定；統(tǒng)計分析證明該研究建立的模型可用，確定的最佳提取工藝條件為料液比15.79∶1、提取時間80 min、提取溫度60 ℃，預(yù)測黃酮提取率最大，為0.108 5%，與實測值相吻合。

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