紅芽大戟組織培養(yǎng)研究進展

摘要[目的]論述紅芽大戟組織培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀。[方法]從外植體的選擇及消毒、培養(yǎng)基及激素選擇、組培苗生根及移栽等方面進行論述，并探討了紅芽大戟組織培養(yǎng)研究中存在的問題以及未來的研究和發(fā)展方向。[結(jié)果]芽或莖尖是紅芽大戟組織培養(yǎng)合適的外植體；不同植物種類或不同品種對激素的要求不同，目前所采用的培養(yǎng)基主要為MS、B5、Miller培養(yǎng)基，不同誘導(dǎo)階段所采用的培養(yǎng)基的種類和濃度也不盡相同；組培苗移栽主要注意基質(zhì)、移栽溫度和濕度、移栽季節(jié)及水肥等方面。組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究仍處在初步研究階段，技術(shù)尚未成熟，今后應(yīng)該加強研究的關(guān)鍵問題主要有解決外植體污染難題，提高外植體誘導(dǎo)成功率；提高芽苗生根率及組培苗移栽成活率等。[結(jié)論]該研究為人工栽培紅芽大戟提供有價值的參考。

關(guān)鍵詞 紅芽大戟；組織培養(yǎng)；外植體；培養(yǎng)基；生根

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10136-03

基金項目廣西自然科學基金（2010GXNSFB013022）；廣西科學院基金（12YJ25SWS22）。

作者簡介張紅巖（1980-），女，山東濰坊人，助理研究員，碩士，從事熱帶經(jīng)濟作物組培及轉(zhuǎn)基因研究工作。*通訊作者，副研究員，從事熱帶經(jīng)濟作物組培及轉(zhuǎn)基因研究工作。

紅芽大戟（Knoxia valerianoides Thorel et Pitard）別名紅大戟、紫大戟、廣大戟、將軍草等，為茜草科多年生草本植物，主產(chǎn)廣西、廣東，生于低山坡草叢中的半陰半陽處[1-2]。紅芽大戟以塊根入藥，主要化學成分為蒽醌類化合物，主治胸腹積水、痰飲喘滿、水腫腹脹、二便不利、癰腫瘡毒等，具有瀉水、解毒、散結(jié)的功效。還具有抗菌作用，特別是對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌有較強的抑制作用，可以治療狂癥，是中成藥紫金錠的主藥[3-4]。

紅芽大戟作為一種珍貴的中藥材，繁殖非常緩慢，在自然界中主要通過種子繁殖。但由于種胚發(fā)育不良，自然散落的種子發(fā)芽率不到l%。采用常規(guī)方法貯藏1年以上的種子，基本喪失活力，幾乎不能出苗[5-6]。近年來，隨著紅芽大戟市場需求量的增加，其價位不斷上升而引發(fā)了濫采亂挖，致使野生資源已瀕臨枯竭[7]。20世紀80年代后雖然已開展人工栽培試驗研究，但均因種苗問題而難以推廣。紅芽大戟組織培養(yǎng)和快速繁殖不僅對保護野生藥用植物資源有著積極的意義，且能縮短其生長周期，實現(xiàn)快速繁殖，滿足市場對紅芽大戟藥材的需求；同時，廣闊的市場需求空間和開發(fā)利用也必定帶動了種植業(yè)、藥材加工業(yè)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[8]。筆者從外植體選擇及處理、植物生長調(diào)節(jié)劑使用、組織培養(yǎng)條件和組培苗的移栽等方面，對近年來紅芽大戟組織培養(yǎng)的研究概況進行綜述，以期為以后的研究提供有價值的參考。

1外植體材料的選擇和處理

1.1外植體的選擇外植體是指從植物組織或器官上切割下來并用于組織培養(yǎng)的原始體小塊[9]。目前組織培養(yǎng)已經(jīng)獲得成功的植物，外植體幾乎包括了植物體的各個部位。但不同種類的植物以及同種植物不同的器官，對誘導(dǎo)條件的反應(yīng)不同，有的部位誘導(dǎo)成功率高，而有的部位很難脫分化；有時，即使脫分化，再分化頻率也很低，或僅分化出芽而不長根，或僅長根而不長芽。因此，外植體類型是影響植物組織培養(yǎng)效果的首要因素[10]。目前有關(guān)紅芽大戟組織培養(yǎng)報道中，采用的外植體材料大多為新生枝莖尖，也有用葉片、莖段等材料的報道。韋瑩等將紅芽大戟葉片、嫩芽、莖段作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，均能誘導(dǎo)出愈傷組織，葉片的愈傷組織體積很小，緊密；嫩芽和莖段的愈傷組織質(zhì)量較好、疏松、體積較大，但除嫩芽外，葉片和莖段的愈傷組織在分化培養(yǎng)中均無法分化出綠點和叢生芽；試驗結(jié)果表明，嫩芽是最適宜紅芽大戟愈傷組織誘導(dǎo)分化的最佳外植體[11]。這與陳芳清等的研究結(jié)果[12]相似，在莖、葉和芽3種外植體中，芽的出愈率最高，愈傷組織褐化率低，生長最好，且易被誘導(dǎo)出不定芽，是較理想的快速繁殖材料；而莖和葉的愈傷組織褐化率高，難以誘導(dǎo)出不定芽。凌征柱等以莖尖為外植體經(jīng)愈傷后得到叢生芽[8]。以上結(jié)果表明，芽或莖尖是紅芽大戟組織培養(yǎng)合適的外植體。

1.2外植體的處理外植體材料的滅菌消毒是植物組織培養(yǎng)的第一步，也是外植體初代培養(yǎng)中關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)。這一環(huán)節(jié)決定了組織培養(yǎng)工作能否進行下去[13]。組織培養(yǎng)中常用的滅菌劑的種類很多，常用的有次氯酸鈉溶液（含有效氯0.4%～0.5%）、過氧化氫10%～12%水溶液、升汞0.1%水溶液，其中前2種滅菌劑對接種材料比較安全，但滅菌時間較長，常使接種材料外層氧化變褐，且滅菌效果不如升汞。升汞有很強的殺菌能力，但浸泡時間稍長，會造成接種材料中毒，滅菌10 min后，大部分分生組織褐化嚴重，因此，材料消毒處理時間不能過長。凌征柱等將紅大戟嫩莖置于洗衣粉水中浸泡10 min，用自來水流水沖洗20 min；在超凈工作臺上用0.1%HgCl2浸泡消毒8 min，然后用無菌水浸洗4次，每次2 min[8]。黃浩用自來水將表面塵土沖洗干凈，用75%的酒精進行表面擦拭消毒，然后在無菌操作臺中剪成長度約為2 cm的植株段和單獨的葉片，置于已滅菌的寬口瓶用0.1%HgCl2浸泡10 min，并不斷地搖動，然后用無菌水沖洗4～5遍，再用已滅菌過的濾紙吸干表面水分置于超凈臺上備用[14]。

2 培養(yǎng)基及激素的選擇

培養(yǎng)基的種類、激素成分和組合對外植體的分化至關(guān)重要。對植物組織培養(yǎng)而言，一旦外植體確定，影響其再生效果的最為關(guān)鍵因素即為培養(yǎng)基（激素的種類及濃度）和培養(yǎng)條件，不同植物種類或不同品種對激素的要求不同。目前有關(guān)紅芽大戟組織培養(yǎng)報道，所采用的培養(yǎng)基主要為MS、B5、Miller培養(yǎng)基，不同誘導(dǎo)階段所采用的培養(yǎng)基的種類和濃度也不盡相同。

2.1誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基在植物組織培養(yǎng)中，主要目標誘導(dǎo)愈傷組織形成和形態(tài)發(fā)生，使一個離體的細胞、一塊組織或一個器官的細胞通過脫分化形成愈傷組織，并由愈傷組織再分化形成植物體。有關(guān)紅芽大戟誘導(dǎo)愈傷的報道多采用MS培養(yǎng)基，所用的激素主要為6-BA及NAA。凌征柱等將消毒好的外植體接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L）上，約15 d后，莖尖的切口處開始膨大產(chǎn)生乳白色的愈傷組織；愈傷組織隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大并變淺黃色；大約25 d后在切口處長有愈傷組織的地方長出叢生芽2～3個；35 d后，便可形成6～8個芽的叢芽；60 d后，就能長出帶有3～4節(jié)8 cm高的小苗[8]。韋瑩等研究不同激素種類及濃度對紅芽大戟愈傷組織的影響發(fā)現(xiàn)，紅芽大戟的嫩芽和莖段在含有不同濃度2，4-D培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的愈傷組織誘導(dǎo)率很高，均達95%以上，且無褐化，但愈傷組織質(zhì)量隨濃度的增大呈先增加后降低的趨勢，濃度為1.0～1.5 mg/L效果最好，但愈傷組織均呈透明淡黃色，質(zhì)地疏松，分化培養(yǎng)基中無法分化叢生芽，因此，2， 4-D不利于紅芽大戟愈傷組織的誘導(dǎo)； 經(jīng)過進一步對6-BA及NAA的濃度及比例進行優(yōu)化，得到紅芽大戟愈傷最優(yōu)激素組合為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L[11]。

2.2繼代增殖增殖培養(yǎng)是一個既要保障試管苗健壯生長，又要保證隱芽、腋芽以及不定芽的分化和生長的過程[15]。芽的增殖和生長受到培養(yǎng)基中的細胞分裂素和生長素（NAA）含量的控制。凌征柱等研究的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的叢芽，切成帶有愈傷組織的2個芽為一叢，接種于繼代增殖培養(yǎng)基（MS+BA 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L）上；15 d后，在基部的節(jié)上長出叢芽5～6個，25 d后，新長的叢芽就可達到6～8 cm高[8]。黃浩研究不同激素種類及濃度對紅芽大戟繼代增殖培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，在繼代培養(yǎng)中，應(yīng)同時添加6-BA、NAA和MET，較好的濃度配比為6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+MET 0.8 mg/L，芽增殖倍數(shù)最高可達4.20倍[14]。張弘等采用平鋪的方式，將誘導(dǎo)出的叢生芽接種于MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基中，芽增殖數(shù)最高為6.98[16]。

2.3生根不定根的形成是組織培養(yǎng)過程中非常關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它直接影響到組培苗移栽成活率的高低[17]。組培苗的生根效果與培養(yǎng)基的組成、添加激素的種類及濃度有關(guān)。黃浩等以紅芽大戟繼代苗為試驗材料，1/2 MS為基本培養(yǎng)基，研究了不同濃度的生長素、多效唑（MET）、生根粉（ABT）對紅芽大戟組培苗生根誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明，NAA不利于紅芽大戟的生根誘導(dǎo)，IBA和IAA單一使用的最佳濃度均為0.5 mg/L，IAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L的配組處理對根的誘導(dǎo)效果相對較好；MET在濃度為1.4 mg/L時對紅芽大戟生根誘導(dǎo)效果最好；最佳的生根誘導(dǎo)激素配組為MET l.4 mg/L+IBA 0.2 mg/L，生根率、平均生根條數(shù)和平均根粗達最大，分別為89%、6.27條和0.78 mm[7]。凌征柱等將長至6 cm以上高的健壯芽苗單個切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（1/2MS+NAA 1.0 mg/L）上培養(yǎng)，15 d后，芽苗的基部與培養(yǎng)基相接觸的莖段膨大，28 d后，莖段膨大的地方長出10條左右的須根，靠近基部的1～3節(jié)上亦有少量（2～3條/節(jié)）須根長出，生根率100%[8]。張弘等研究紅芽大戟的最佳誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L NAA或1/2MS+0.1 mg/L ABT，生根率均可達100%[16]。

3 組培苗的移栽

組培苗移栽是關(guān)系到能否實現(xiàn)工廠化育苗的關(guān)鍵，目前對紅芽大戟組培苗移栽報道的主要是從基質(zhì)、移栽溫度和濕度、移栽季節(jié)及水肥等方面的研究。移栽基質(zhì)的選擇原則是疏松透氣，具有一定的保水保肥能力[18]。移栽的試管苗植株和活體生根的小植株，濕度控制十分重要。因為試管苗在培養(yǎng)瓶培養(yǎng)時為高濕（相對濕度為90%～100%）環(huán)境，莖葉表面沒有防止水分散失的角質(zhì)層，根系不發(fā)達，即使移栽后根系周圍有足夠的水分也難以保證水分平衡。在紅芽大戟生根苗移栽到基質(zhì)后，要覆蓋塑料薄膜、經(jīng)常噴水霧，控制相對濕度不低于85%，提高空氣濕度，減少葉面蒸騰；同時，控制溫度在30 ℃以下，避免溫度過高導(dǎo)致蒸騰作用加強，水分失衡和微生物滋生等；在10～20 d，可半揭開塑料薄膜，逐漸降低相對濕度，使其漸漸適應(yīng)自然環(huán)境；20 d后，可完全去掉塑料薄膜，但要注意保證土壤的濕度。另外，在移栽的過程中，還需加蓋遮蔭網(wǎng)，以控制光照強度，避免陽光直射。黃浩等以紅芽大戟組培生根苗為移栽材料，研究了不同基質(zhì)、水肥處理和季節(jié)對紅芽大戟組培苗移栽效果的影響，結(jié)果表明，較佳的移栽季節(jié)為2～4月，噴施0.07%的KH2PO4溶液有利紅芽大戟組培苗的移栽生長，以泥炭+珍珠巖（1∶1）作為移栽基質(zhì)效果最好，在移栽后10 d，加強對移栽苗的管理，相對濕度不低于85%，溫度控制在15～30 ℃，成活率可達85%以上[19]。凌征柱等將發(fā)育良好、具有3個節(jié)以上的試管苗瓶蓋打開，置室內(nèi)常溫下煉苗3～4 d，取出小苗，用清水洗去根部培養(yǎng)基，因為紅大戟試管苗沒長有主根，全部為須根，直接移栽營養(yǎng)杯紅大戟試管苗較難成活，為提高紅大戟試管苗的移栽成活率，應(yīng)先移植到陰蔽度為70%的育苗棚內(nèi)的沙床中（細河砂），待須根長得粗壯一些再移植到營養(yǎng)杯進行培植[8]。

4存在問題及展望

紅芽大戟組織培養(yǎng)研究的成功，解決我國對紅芽大戟資源保護、因自然繁殖困難導(dǎo)致藥材緊缺等難題，不僅對保護野生藥用植物資源有著積極的意義，且能縮短其生長周期，實現(xiàn)快速繁殖，滿足市場對紅芽大戟藥材的需求；成功解決了多年人工栽培渴望解決的種苗問題，對推動人工栽培紅大戟起著很重要的作用，對保護瀕臨滅絕的紅大戟野生資源及可持續(xù)利用有著積極的意義。但紅芽大戟的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究仍處在初步研究階段，技術(shù)尚未成熟，還沒有形成一個比較完善的技術(shù)體系，還不能實現(xiàn)紅芽大戟的工廠化育苗，尚有許多問題需進一步研究與完善。今后應(yīng)該加強研究的關(guān)鍵問題主要有解決外植體污染難題，提高外植體誘導(dǎo)成功率；提高芽苗生根率及組培苗移栽成活率等。

參考文獻

[1] 郭曉莊.有毒中草藥大辭典[K].天津：天津科技翻譯出版公司，1992：243-245.

[2] 《全國中草匯編》編寫組.全國中草藥匯編（上冊）[G].北京：人民衛(wèi)生出版社，1975：382-383.

[3] 粱忠紀.紅芽大戟前景廣闊[J].農(nóng)村新技術(shù)，2002（8）：55.

[4] 郭曉莊.有毒中草藥大辭典[M].天津：天津科技翻譯出版公司出版，1992：243-245.

[5] 陳芳清，徐祥潔.藥用植物紅芽大戟的個體生態(tài)學研究[J].武漢植物學研究，1995，13（2）：147-151.

[6]何茂全，胡延松，黃健君.紅大戟的生態(tài)環(huán)境及生物學特性的觀察[J].中國野生植物資源，1994（2）：12-14.

[7] 黃浩，韋鵬霄，岑秀芬，等.激素因子對野生紅芽大戟組培苗生根誘導(dǎo)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35（22）：6813-6815.

[8] 凌征柱，覃文流，余麗瑩，等.紅大戟的組織培養(yǎng)及植株再生[J].中草藥，2005，36（10）：1555-1557.

[9] 曹孜義，劉國民.實用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M].蘭州：甘肅科學技術(shù)出版社，2002.

[10] 堯俊英，劉蘇萌，馮昕，等.山藥組織培養(yǎng)研究進展[J].河北農(nóng)業(yè)科學，2009，13（9）：51-53.

[11] 韋瑩，余麗瑩，黃浩，等.紅芽大戟愈傷組織誘導(dǎo)及分化研究[J].廣西植物，2009，29（6）：817-821.

[12] 陳芳清，丘安機，徐祥浩，等.藥用植物紅芽大戟的組織培養(yǎng)[J].廣西植物，1997，17（2）：149-151.

[13] 宮永紅.核桃組織培養(yǎng)研究進展[J].林業(yè)科技開發(fā)， 2009，23（2）：5-8.

[14] 黃浩.藥用植物紅芽大戟組織培養(yǎng)的研究[D].南寧：廣西大學，2006.

[15] 趙鑫，詹立平，鄒學忠.牡丹組織培養(yǎng)研究進展[J].核農(nóng)學報， 2007，21（2）：156-159.

[16] 張弘，侯麗麗，高帥，等.紅芽大戟的組培快繁技術(shù)研究[J].熱帶林業(yè)，2013，41（3）：39-40.

[17] 王會.紅葉石楠組培苗生根培養(yǎng)的研究[J].北方園藝，2007（10）：178-180.

[18] 陸從巍，趙震虎，王鵬，等.提高花卉組培苗移栽成活率的技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2005（4）：22-23.

[19] 黃浩，韋鵬霄，岑秀芬，等.紅芽大戟組培苗移栽技術(shù)的研究[J].熱帶農(nóng)業(yè)科技，2007，30（3）：27-31.