一種棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育系線粒體RNA的提取方法

摘要[目的]獲得高質(zhì)量的棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育系線粒體RNA。[方法]以哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系黃化苗為研究對(duì)象，對(duì)棉花線粒體RNA的提取方法進(jìn)行探討。[結(jié)果]采取先分離出棉花線粒體再提取RNA的方法，最終獲得了質(zhì)量較好的線粒體RNA（mtRNA）。[結(jié)論] 成功獲得了質(zhì)量較高的mtRNA。

關(guān)鍵詞棉花；線粒體RNA提??；方法

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）29-10097-02

作者簡(jiǎn)介鞏養(yǎng)倉(cāng)（1981- ），男，河南淮陽(yáng)人，助理研究員，碩士，從事棉花遺傳育種研究。

RNA作為遺傳和表達(dá)的媒介，是目前分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中重要的研究對(duì)象。線粒體是動(dòng)植物及人類細(xì)胞重要的細(xì)胞器，具有半自主性，含有少量的DNA遺傳物質(zhì)，且有一套相對(duì)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，合成自身所需要的特異蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體基因組與植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育密切相關(guān)[1-4]，并推測(cè)線粒體基因組重組或重排以及RNA編輯現(xiàn)象可能是導(dǎo)致植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育的重要原因[5-8]。因此，對(duì)線粒體基因組的研究成為細(xì)胞質(zhì)雄性不育研究的熱點(diǎn)。提取高質(zhì)量的線粒體DNA及RNA是進(jìn)行這些研究的第一步，也是關(guān)鍵的一步。關(guān)于線粒體RNA的提取，在玉米[9]、 馬鈴薯[10]、油菜[11]等作物上已經(jīng)相當(dāng)成熟，而在棉花上，雖有關(guān)于棉花線粒體DNA提取方法的介紹[12-13]，但關(guān)于棉花線粒體RNA提取方法尚未見報(bào)道。為此，筆者對(duì)此進(jìn)行了初步探討。

1材料與方法

1.1材料哈克尼西棉（Gossypium harknessii）細(xì)胞質(zhì)雄性不育系種子（由中國(guó)農(nóng)科院棉花研究所雜種優(yōu)勢(shì)利用課題組提供）。

1.2方法

1.2.1材料準(zhǔn)備。將哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系種子經(jīng)溫水浸泡4 h，種植于無菌沙中，30 ℃暗培養(yǎng)7 d左右，培養(yǎng)成黃化苗備用。

1.2.2試劑準(zhǔn)備。緩沖液A： 0.05 mol/L TrisCl，0.5 mol/L Sucrose，0.005 mol/L EDTA·Na2，0.1%BSA，1%～2% PVP，0.005 mol/L巰基乙醇，pH 7.5；緩沖液B： 0.05 mol/L TrisCl，0.3 mol/L Sucrose，0.01 mol/L氯化鎂，1% PVP，pH 7.5；緩沖液C： 0.05 mol/L TrisCl，0.3 mol/L Sucrose，0.01 mol/L氯化鎂；緩沖液D： 0.01 mol/L TrisCl，0.6 mol/L Sucrose，0.002 mol/L EDTA·Na2，pH 7.5；RNA抽提液：2%CTAB，2%PVP，0.1 mol/L TrisHCl（pH 8.0），0.025 mol/L EDTA·Na2 （pH8.0），2.0 mol/L NaCl?；靹颍?.1%DEPC處理過夜，滅菌，用前加入終體積為2%的巰基乙醇。

氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V）；DEPC處理水；10 mol/L LiCl，加0.1%的DEPC處理過夜，滅菌，室溫保存；100%乙醇；70%乙醇用DEPC水配制，-20 ℃保存；3 mol/L醋酸鈉（pH 5.2），加0.1%的DEPC處理過夜，滅菌。

1.2.3線粒體制備。線粒體制備主要是將線粒體從細(xì)胞中分離出來并保證其完整性。由于低溫能夠減緩線粒體氧化，為保證線粒體在提取過程中的穩(wěn)定狀態(tài)，整個(gè)操作都在冰上完成，并在無菌通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。步驟如下：① 收集黃化苗，棄根，用滅菌水洗滌2次，置于研缽中；② 加入約4倍體積的緩沖液A，將組織研磨成糊狀；③ 通過8層紗布過濾入50 ml離心管中，離心（2 400 r/min，4 ℃，10 min），以除去大的細(xì)胞碎片；④ 取上清，2 500 r/min冷凍離心10 min，以除去質(zhì)體；⑤ 將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，8 000 r/min離心35 min，棄上清；⑥ 沉淀用緩沖液B懸浮后，8 000 r/min離心20 min，棄上清；⑦ 沉淀用20 ml緩沖液C懸浮，再用長(zhǎng)針頭注射器向管底緩緩注入20 ml緩沖液D，形成一個(gè)step梯度，冰浴30 min，然后8 000 r/min離心20 min，棄上清液；⑧ 沉淀再用20 ml緩沖液D懸浮，8 000 r/min離心20 min，重復(fù)2～3次，得到的沉淀即為線粒體。

1.2.4mtRNA提取。mtRNA的提取主要參照MA等[14]提取棉花總RNA的改良CTAB法，略有改動(dòng)，具體步驟如下：①向沉淀中加入適量體積的提取液，65 ℃水浴10 min，劇烈振蕩；②加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1，V/V）抽提，劇烈振蕩，10 000 r/min，4 ℃離心10 min，重復(fù)1～2次；③取上清，加入1/4體積的10 mol/L LiCl，混勻，4 ℃過夜沉淀；④10 000 r/min，4 ℃離心10 min，沉淀溶于DEPC處理水中；⑤加入等體積酚/氯仿抽提1次； ⑥取上清，加入1/10體積醋酸鈉，2.5倍體積的無水乙醇，-70 ℃沉淀至少30 min；⑦離心（12 000 r/min，4 ℃，15 min），70%乙醇洗滌沉淀，在超凈工作臺(tái)上風(fēng)干mtRNA，用10 μl DEPC處理水溶解，儲(chǔ)存于-70 ℃冰箱。

1.2.5mtDNA檢測(cè)。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。使用1.2%瓊脂糖凝膠，取2 μl mtRNA樣品在小型電泳槽中進(jìn)行電泳，電壓70 V，電泳時(shí)長(zhǎng)30 min，用0.01%溴化乙錠（EtBr）溶液浸泡20 min，然后置于紫外燈下觀察并拍照保存。

2結(jié)果與分析

由圖1可知，沒有降解的mtRNA 能夠看見2條清晰的核糖體RNA帶（26S 和18S），且26S的亮度約是18S 的2倍。由此可知，該方法所提取的mtRNA基本達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量可以滿足進(jìn)一步的分子生物學(xué)試驗(yàn)。

3討論

獲得高質(zhì)量的核酸是進(jìn)行分子生物學(xué)相關(guān)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)下一步試驗(yàn)的進(jìn)行和結(jié)果都有很大的影響。RNA質(zhì)量好壞主要體現(xiàn)在兩點(diǎn)：一是完好性，所提取的核酸能否體現(xiàn)在動(dòng)植物體內(nèi)的自然長(zhǎng)度，是否發(fā)生了降解；二是純度，即是否有其他非核酸物質(zhì)及DNA的污染，而對(duì)mtRNA而言，又要去除基因組RNA的污染。所以mtRNA的抽提，一方面要利用合適的方法去除雜質(zhì)，另一方面要提供合適的環(huán)境，避免對(duì)核酸的損傷。

該試驗(yàn)首先從細(xì)胞中分離出完整的線粒體，然后再提取RNA。該方法避免了基因組DNA和RNA的污染，但如何分離出完整的線粒體是試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。線粒體是細(xì)胞中最為活躍的細(xì)胞器之一，極易發(fā)生氧化破裂，該研究參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)并經(jīng)過多次試驗(yàn)，成功分離出棉花完整的線粒體。

針對(duì)RNA的抽提，前人已經(jīng)做了大量的研究[15-17]。相對(duì)于其他植物而言，棉花RNA抽提具有其特殊性，棉花各組織特別是花藥、胚珠、纖維細(xì)胞內(nèi)常含有豐富的多糖、脂類以及酚類等次生物質(zhì)，如果這些物質(zhì)不能有效地去除，會(huì)嚴(yán)重影響核酸的純度，進(jìn)而影響后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行，所以棉花RNA的抽提比其他植物更困難。該試驗(yàn)采用提取棉花總RNA較為成熟的改良CTAB法提取線粒體中的RNA，獲得了質(zhì)量較高的mtRNA。但該方法由于操作較繁瑣，造成mtRNA的嚴(yán)重流失，該試驗(yàn)中，應(yīng)用約20 g新鮮材料最后只得到了約0.5 μg的mtRNA，雖然質(zhì)量能夠滿足一般試驗(yàn)的要求，但數(shù)量不足，很難完成對(duì)RNA數(shù)量要求較多的分子試驗(yàn)，如Northern雜交。所以如何提取出高質(zhì)量高產(chǎn)出比的mtRNA，還需要進(jìn)一步地探討。

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