IgY抗體在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

摘要 卵黃免疫球蛋白（Immunoglobulin of yolk，IgY） 是鳥類、爬行動(dòng)物和兩棲類動(dòng)物體內(nèi)的主要抗體，與哺乳動(dòng)物IgG功能類似，一般從被抗原免疫的母雞卵黃中提取。與IgG相比，IgY具有許多突出的優(yōu)點(diǎn)，在制備針對(duì)多種抗原的多克隆抗體、免疫檢測(cè)、人類和動(dòng)物疾病的預(yù)防治療等方面均得到廣泛應(yīng)用。對(duì)IgY在免疫檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞 IgY；免疫檢測(cè)；應(yīng)用

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）29-10147-03

作者簡(jiǎn)介張靜靜（1980- ），女，山東濰坊人，中級(jí)工程師，碩士，從事生物技術(shù)方面的研究。

傳統(tǒng)上，使用哺乳動(dòng)物來源的IgG抗體作為檢測(cè)抗體，應(yīng)用免疫擴(kuò)散、ELISA、免疫印跡法等技術(shù)手段，可以定性或定量檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體。卵黃免疫球蛋白（Immunoglobulin of yolk），又稱為IgY或卵黃抗體，是鳥類、爬行動(dòng)物和兩棲類動(dòng)物體內(nèi)的主要抗體，一般從被抗原免疫的母雞卵黃中提取。與IgG相比，IgY具有抗原用量少、制備周期短、對(duì)動(dòng)物損傷小、產(chǎn)量大、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，近年來逐漸引起人們的關(guān)注，應(yīng)用越來越廣泛。筆者綜述了IgY在免疫檢測(cè)方面的應(yīng)用研究進(jìn)展。

1IgY的分子結(jié)構(gòu)

與IgG大分子結(jié)構(gòu)類似，IgY大分子也包括2條重鏈和2條輕鏈，鏈的形態(tài)類似于希臘字母“Y”， Fc區(qū)存在2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。然而，IgG和IgY之間存在明顯的差異。IgG分子量為160 kD，IgY分子量為180 kD；IgY沒有真正的鉸鏈區(qū)，有人認(rèn)為IgY重鏈的Cυ2區(qū)后來進(jìn)化成了哺乳動(dòng)物IgG的鉸鏈區(qū)。另外，IgY能夠介導(dǎo)過敏反應(yīng)，與哺乳動(dòng)物IgE抗體功能一致，功能結(jié)構(gòu)也存在相似性，有人認(rèn)為IgY是IgG 和 IgE的起源分子[1]。IgY重鏈分子量為67～70 kD，有1個(gè)可變區(qū)（V）和4個(gè)穩(wěn)定區(qū)（C）。輕鏈分子量為25 kD，包含1個(gè)可變區(qū)和1個(gè)穩(wěn)定區(qū)。與IgG相比，IgY輕鏈分子量要小，限制了Cυ2區(qū)的流動(dòng)性。IgY的疏水基團(tuán)多于IgG。比較IgG和IgY的C端序列，IgG的 Cγ2和 Cγ3區(qū)與 IgY的 Cυ3和 Cυ4區(qū)十分相似[2]。

2IgY抗體應(yīng)用于免疫檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

2.1易獲得，產(chǎn)量高傳統(tǒng)方法通過采血和宰殺動(dòng)物收集抗體，IgY從卵黃中提取，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和操作者都無損傷，簡(jiǎn)單易行，經(jīng)濟(jì)溫和。同時(shí)，與IgG相比，IgY產(chǎn)量高。按1只母雞每月產(chǎn)20只雞蛋計(jì)算，每只母雞1個(gè)月能生產(chǎn)至少2 g IgY，相當(dāng)于1只大型哺乳動(dòng)物血清中抗體的含量[1]。近年來，隨著雞源性抗體片段分離報(bào)道的增加，引起了科學(xué)家們建立雞抗體庫的興趣[3]。例如，Nishibori等[4]獲得了人源性雞單克隆抗-IL12抗體。重組技術(shù)的的應(yīng)用可以在無需免疫的情況下從雞抗體庫里篩選到IgY或IgY類抗體。

2.2假陽性或假陰性率低，特異性強(qiáng)研究表明，IgY不與血清中的類風(fēng)濕因子（RF）、人抗鼠抗體（HAMA）、抗-IgG抗體和抗體結(jié)合物發(fā)生交叉反應(yīng)，不激活補(bǔ)體系統(tǒng)等，也不與葡萄球菌蛋白A和鏈狀球菌蛋白G發(fā)生反應(yīng)，可以明顯減少假陽性或假陰性的產(chǎn)生，增強(qiáng)檢測(cè)特異性[5]。

2.3靈敏度高由于禽類和哺乳動(dòng)物之間存在明顯的種系和基因?qū)W背景差異，IgY能識(shí)別更多的哺乳動(dòng)物抗原表位，從而增強(qiáng)免疫信號(hào)。研究表明，IgY的抗體親和力為鼠抗IgG的3～5倍[3]。

2.4性質(zhì)穩(wěn)定與IgG相比，IgY具有耐熱、耐酸和一定的抗酶降解的能力。在PH4-9以及小于65 ℃的溶液中，IgY能夠保持穩(wěn)定。研究還發(fā)現(xiàn)，IgY具有耐高滲性能 （在60%的高濃度蔗糖溶液中仍有活性）和很好的耐反復(fù)凍融的特性[5]。

3 IgY抗體在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1寄生蟲感染的檢測(cè)旋毛蟲幼蟲進(jìn)入宿主體內(nèi)后，排泄-分泌物（Excretorysecretory，ES）會(huì)形成循環(huán)抗原（Circulating antigens，CAg），CAg在血液出現(xiàn)的時(shí)間早于抗體，其半衰期短于抗體，因此檢測(cè) CAg可區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，尤其適用于早期診斷和療效考核。但是，由于CAg在血清中的含量通常較低，常規(guī)的夾心法ELISA檢測(cè)旋毛蟲感染小鼠與豬CAg檢出率僅為19%～54%，旋毛蟲病患者血清中的CAg檢出率僅為29.9%。Liu等[6]制備了抗-ES-IgY，以抗-ES-IgY作為捕獲抗體建立夾心法ELISA，檢測(cè)敏感度達(dá)到1 ng/ml。

Lei等[7]制備了抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原（Soluble egg antigen，SEA）的IgY（抗-SEA IgY），并將抗-SEA IgY耦聯(lián)在納米磁珠上，建立了基于IgY的免疫磁珠夾心ELISA法（IgYIMB-ELISA），應(yīng)用IgYIMBELISA法檢測(cè)血吸蟲感染小鼠血清和尿液中及血吸蟲病患者血清中的循環(huán)可溶性蟲卵抗原。這為檢測(cè)日本血吸蟲感染提供了新的技術(shù)。

3.2細(xì)菌感染及污染的免疫檢測(cè)副溶血性弧菌是海水養(yǎng)殖中主要的病原菌之一，不僅能引起魚蝦等多種水產(chǎn)動(dòng)物的疾病，而且能通過污染水產(chǎn)品而導(dǎo)致人食物中毒。常規(guī)檢測(cè)方法周期長、操作復(fù)雜，已經(jīng)不能滿足當(dāng)今食品安全檢測(cè)的需要。何斌彬等[8]制備了抗副溶血性弧菌的特異性IgY，建立間接ELISA法檢測(cè)副溶血性弧菌。結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，對(duì)純培養(yǎng)菌液的檢出限為1.0×105cfu/ml，具有良好的敏感性。

金黃色葡萄球菌感染食品后產(chǎn)生的金黃色葡萄球菌腸毒素（SEs），是引起金黃色葡萄球菌食物中毒的主要原因。Jin 等[9]制備了抗- SEs -IgY，代替IgG應(yīng)用在檢測(cè)SEs的雙抗體夾心ELISA、膠體金方法中。結(jié)果表明，新的檢測(cè)方法樣品不需要稀釋，不受葡萄球菌A蛋白的干擾，省時(shí)，敏感度高，膠體金方法能夠在15 min內(nèi)檢測(cè)出牛奶中0.2 ng/ml的SEs。Reddy等[10]建立了應(yīng)用IgY的檢測(cè)金黃色葡萄球菌毒素A（SEA）的免疫捕獲PCR-ELISA的方法，檢測(cè)敏感度可達(dá)約10 pg/ml。

3.3病毒感染的免疫檢測(cè)為了判斷感染呼吸綜合癥冠狀病毒（SARSCoV）疑似個(gè)體的存在及感染程度，Palaniyappan等[11]制備了抗-SARSCoV NP（呼吸綜合癥冠狀病毒衣殼蛋白）IgY，建立了檢測(cè)SARSCoV NP的夾心法ELISA，靈敏度達(dá)到18.5 pg/ml，并且能夠定量檢測(cè)SARSCoV。禽類呼腸弧病毒（ARV）在家禽飼養(yǎng)中是引起家禽養(yǎng)殖損失的重要致病因素，病毒外層衣殼蛋白（σC），特異性結(jié)合禽類細(xì)胞，在ARV感染和致病時(shí)起重要作用。Jung等[12]克隆了σC基因，在E.coli中進(jìn)行表達(dá)，并制備了重組ARVσC的IgY抗體，此IgY抗體能夠中和感染ARV的乳倉鼠腎細(xì)胞中的ARV，也可以應(yīng)用在ELISA和斑點(diǎn)雜交法中特異檢測(cè)ARV，不受其他病毒的干擾。

目前，重組IgY抗體也被應(yīng)用在病毒的檢測(cè)中。Kazuyoshi等[13]制備了2個(gè)重組IgY抗體：Ab315 和 Ab419可結(jié)合哺乳動(dòng)物朊蛋白（PrP）。試驗(yàn)表明，其在識(shí)別牛海綿狀腦病朊蛋白和羊瘙癢病致病朊蛋白時(shí)具有較高的敏感性，顯示了其在診斷朊蛋白病方面的良好前景。

3.4臨床標(biāo)志物的免疫檢測(cè)

3.4.1腫瘤標(biāo)志物的免疫檢測(cè)。目前，腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)在腫瘤診斷、療效判定、隨訪觀察等方面發(fā)揮了越來越重要的作用。其中，抗腫瘤標(biāo)志物IgY抗體的應(yīng)用使腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)靈敏度、特異性、定量等方面的優(yōu)勢(shì)得到進(jìn)一步提升。

CA153是一種乳腺癌細(xì)胞和某些上皮細(xì)胞分化抗原，在乳腺癌診斷和判斷預(yù)后中位于首位。Grzywa 等[14]制備抗-CA153 IgY，建立雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)CA153，敏感度達(dá)0.028 U/ml。HER2為I型生長因子受體中的一種穿膜糖蛋白，在細(xì)胞膜上以單體形式存在，被激活后能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和分化，在人乳腺癌中的激活也比較常見。Xiao等[15]構(gòu)建了抗- HER2 IgY與單壁碳納米管（SWNTs）的結(jié)合物，研究表明此結(jié)合物能夠特異性的導(dǎo)向表達(dá)HER2的SK-BR-3細(xì)胞，不結(jié)合不表達(dá)HER2的MCF-7細(xì)胞，顯示了其在腫瘤檢測(cè)和治療方面的良好前景。免疫組化（IHC）是活體組織腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的傳統(tǒng)的重要技術(shù)手段，但由于IgG抗體的非特異性吸附及傳統(tǒng)熒光染料的不穩(wěn)定性，IHC無法實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)活體組織腫瘤標(biāo)志物。Xiao等[16]用IgY代替IgG，結(jié)合量子點(diǎn)熒光技術(shù)，使IHC定量檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物具有羅好的前景。

3.4.2其他臨床標(biāo)志物的檢測(cè)。王春宇等[17]采用表面等離子體共振（SPR）方法，用IgY取代IgG作為識(shí)別分子偶聯(lián)于CM5傳感芯片上，對(duì)人血清中的轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)方法相比該方法簡(jiǎn)單可行，具有良好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。蔣洪嬌等[18]成功制備了抗Cystatin C IgY，建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)體系，證明其在檢測(cè)Cystatin C具有較好的靈敏度和特異性。

艾杜糖-2-硫酸酯酶（IDS）是人體中的一種酶，IDS的缺失引起黏多糖貯積癥Ⅱ型（MPS II）。Sosa AC等[19 ]在巴斯德畢赤酵母中建立了重組IDS（hrIDS）的表達(dá)系統(tǒng)，制備了特異抗-IDS氨基酸序列的IgY抗體，應(yīng)用夾心法ELISA定量檢測(cè)人體液中的IDS以及畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的hrIDS。試驗(yàn)證明，這是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的方法。

3.5其他方面免疫檢測(cè)的應(yīng)用 Sunwoo等[ 20]制備了抗-乳鐵蛋白IgY，建立了定量檢測(cè)乳鐵蛋白的夾心ELISA，此方法既可以應(yīng)用于骨質(zhì)疏松、貧血等疾病的診斷，又可以定量檢測(cè)乳制品中乳鐵蛋白，應(yīng)用于食品檢測(cè)方面。桔霉素是由真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一種真菌毒素，具有一定的毒性。Duan等[21]制備了抗-橘霉素IgY，建立了檢測(cè)橘霉素的間接法ELISA，結(jié)果表明其檢測(cè)靈敏度達(dá)到10 ng/ml，并且能夠在20～640 ng/ml檢測(cè)范圍內(nèi)建立良好的線性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)橘霉素進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果表明IgY應(yīng)用于橘霉素檢測(cè)避免人們攝入橘霉素受到傷害具有良好前景。

4小結(jié)

通過免疫母雞從卵黃中提取特異性的IgY，或者制備特異性的重組IgY，結(jié)合一定的檢測(cè)手段，如間接法ELISA、免疫磁珠夾心ELISA法、膠體金法、應(yīng)用量子點(diǎn)熒光技術(shù)的免疫組化法、構(gòu)建IgY與單壁碳納米管（SWNTs）的結(jié)合物、表面等離子體共振（SPR）方法，IgY可以應(yīng)用于寄生蟲感染、細(xì)菌感染及污染、病毒感染、包括腫瘤標(biāo)志物在內(nèi)的臨床標(biāo)志物、食品等的免疫檢測(cè)中，與IgG的傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，其靈敏度高，特異性強(qiáng)，可進(jìn)行定量檢測(cè)，并且易獲得，產(chǎn)量高，性質(zhì)穩(wěn)定，充分顯示了其在免疫檢測(cè)方面應(yīng)用的良好前景。在實(shí)際應(yīng)用中，若要實(shí)現(xiàn)在免疫檢測(cè)領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，還需要進(jìn)一步研究。

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