銅藻多糖水提法工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

摘要[目的]研究銅藻多糖的水提法提取工藝，并研究其抗氧化活性。[方法]采用水提法提取銅藻多糖，研究提取時(shí)間、提取溫度和料液比等因素對(duì)多糖提取率的影響，以多糖得率為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳提取工藝；并對(duì)銅藻多糖的1，1二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基、超氧陰離子自由基（O-2）的清除能力及抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力進(jìn)行研究。[結(jié)果]該多糖水提法提取的最優(yōu)條件為料液比1∶20 g/ml、時(shí)間3 h、溫度60 ℃，在此條件下，銅藻多糖的提取率為4.9%；銅藻多糖抗氧化活性隨著濃度增加而增強(qiáng)，其超氧陰離子（O-2）和DPPH自由基清除能力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力分別為48.1%、38.8%、34.2%。[結(jié)論]該研究?jī)?yōu)化了銅藻多糖的提取工藝，提取的活性多糖具有一定抗氧化活性，試驗(yàn)優(yōu)化的工藝穩(wěn)定可行，為銅藻多糖的后續(xù)研究和開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞銅藻；多糖；水提；抗氧化活性；工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）29-10139-03

基金項(xiàng)目舟山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012C33004）；2012年浙江海洋學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目“銅藻糖膠制備技術(shù)研究”；浙江海洋學(xué)院2012年科研計(jì)劃項(xiàng)目（面上項(xiàng)目）（X12M05）；浙江海洋學(xué)院科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目“海藻多糖硫酸酯的抗氧化活性研究”。

作者簡(jiǎn)介顧麗霞（1992- ），女，浙江杭州人，本科生，專業(yè)：藥學(xué)。*通訊作者，講師，博士，從事海洋天然產(chǎn)物與健康研究工作。

銅藻Sargassum herneri（Turn）C.Ag.俗稱“丁香屋”，已用于藻膠制造工業(yè)，在農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)藥、食品、飼料工業(yè)等行業(yè)也被廣泛應(yīng)用，具有較高的商業(yè)價(jià)值。民間存有銅藻全藻藥用的習(xí)慣，其有效成分特別是有生物活性的特效成分研究得仍較少，僅見(jiàn)報(bào)道含褐藻酸、甘露醇、多糖等成分[1-2]，因而該藻并未得到有效的開(kāi)發(fā)利用。近些年來(lái)，我國(guó)對(duì)海洋來(lái)源多糖的研究日益廣泛，已有研究表明海洋多糖具有抗衰老、抗輻射、抗病毒、抗心血管疾病及抗氧化活性等功能[3-7]，其中，海藻多糖的開(kāi)發(fā)已逐漸全球化，成為重要的一個(gè)領(lǐng)域。在十幾年前，從褐藻中分離出有較強(qiáng)藥理學(xué)和生物化學(xué)活性的硫酸基多糖吸引了許多學(xué)者們的關(guān)注，闡明了褐藻硫酸多糖具有抗凝血、抗感染、抗炎癥和抗腫瘤等活性[8-10]。為了提高效率、節(jié)約成本，筆者采用熱水提取法提取銅藻中的多糖，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化銅藻多糖的提取工藝，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行研究，為后續(xù)銅藻多糖的開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試原料。銅藻（舟山嵊山島采得）由浙江海洋學(xué)院藥學(xué)系鑒定。

1.1.2主要儀器。UV1100紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；FW80萬(wàn)能粉粹機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；HWS12電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；SB4200DT 超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；FEB852恒溫磁力攪拌器，常州國(guó)華電器有限公司。

1.1.3試劑。葡萄糖、濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等，均為分析純。

1.2方法

1.2.1多糖的提取。取銅藻粉末20 g，過(guò)20目篩，經(jīng)熱水提取法提取后，離心，并取溶液，加入H2O2（3%），4 ℃處理2 h，濃縮后加入乙醇，使乙醇含量為70%，沉淀過(guò)夜，抽濾，濾渣加水溶解，采用Sevage法脫蛋白，將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干，加少量水溶解，加入乙醇進(jìn)行二次醇沉，同樣，沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚淋洗兩次，揮干溶媒，加少量蒸餾水溶解，冷凍干燥的固體即為銅藻多糖。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。采用苯酚-硫酸法[11]測(cè)定多糖含量。精密稱取0.050 g葡萄糖（分析純），加水定容至100 ml，得到濃度為500 μg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確吸取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 ml，分別置于10 ml容量瓶中，補(bǔ)加超純水至2.0 ml，加入1.0 ml苯酚（5%），混合均勻后快速加入7.0 ml濃硫酸（95%），搖勻后室溫放置30 min，于485 nm處測(cè)定其紫外吸光值（A）。以吸光值A(chǔ)為橫坐標(biāo)、葡萄糖的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線1.2.3多糖含量的測(cè)定。精確量取供試品溶液1 ml，加蒸餾水至2 ml后，加1 ml 5%苯酚，搖勻后迅速加入濃硫酸 7.0 ml，搖勻后冷卻至室溫，按照“1.2.2”中的方法測(cè)定吸光度。以吸光度對(duì)應(yīng)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度乘以校正系數(shù)0.9，計(jì)算多糖含量。

1.2.4提取工藝單因素試驗(yàn)。

1.2.4.1最佳溫度確定。取海藻20 g，在料液比1∶20 g/ml，提取時(shí)間為4 h，分別以50、60、70、80 ℃的提取溫度，考察提取溫度對(duì)銅藻多糖提取率的影響。

1.2.4.2最佳料液比確定。取海藻20 g，溫度60 ℃，水提時(shí)間4 h，分別以料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/ml的條件下，考察料液比對(duì)銅藻多糖提取率的影響。

1.2.4.3最佳時(shí)間確定。取海藻20 g，溫度60 ℃，料液比1∶15 g/ml，分別以提取時(shí)間為2、4、6、8、9 h的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)銅藻多糖提取率的影響。

1.2.5提取工藝的正交試驗(yàn)。以提取溫度、提取時(shí)間以及料液比3個(gè)因素為考察對(duì)象，每個(gè)因素3個(gè)水平，選用三因素三水平正交試驗(yàn)（表1），篩選銅藻多糖的最佳提取工藝。

1.3水提法的銅藻多糖抗氧化活性研究

1.3.1DPPH自由基清除的測(cè)定[12]。取不同濃度（0、2、4、6、8和10 mg/ml）的樣品溶液1.0 ml加入4.0 ml 0.004% DPPH溶液，混勻，避光放置30 min，以無(wú)水乙醇作為對(duì)照空白在517 nm測(cè)定其吸光度A，以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，清除率T（%）= [（A0-A1）/A0]×100%，式中，A0為對(duì)照空白吸光度值；A1為待測(cè)液吸光度值。

1.3.2抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的測(cè)定[13]。用磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol/L、pH 7.45）配制卵黃懸液[V（PBS）∶V（卵黃）=25∶1]，取0.4 ml卵黃懸液，分別加入不同濃度（0、2、4、6、8和10 mg/ml）的被測(cè)溶液1.0 ml，再加入0.4 ml、25 mmol/L的硫酸亞鐵，用0.1 mol/L、pH 7.45的PBS補(bǔ)充至4.0 ml，37 ℃氣浴恒溫振蕩器中振蕩15 min，取出后加入1.0 ml、20%的三氯乙酸（TCA）靜置10 min，3 500 r/min 離心10 min，取4.0 ml上清液加入2 ml、0.8%的硫代巴比妥酸（TBA），加塞，沸水浴15 min，冷卻，以6.0 ml PBS為空白調(diào)零管，在532 nm處測(cè)定吸光度；Vc作為陽(yáng)性對(duì)照組，多糖抗氧化活性以抑制卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化效率表示，抑制率I（%）=（A0-A）/A0×100%，式中，A0為空白對(duì)照（未加多糖）的吸光度；A為待測(cè)多糖的吸光度。

1.3.3超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定[14]。在試管中分別加入pH為8.2、濃度0.05 mol/L的TrisHCl緩沖液3 ml，每個(gè)試管加入不同濃度（0、2、4、6、8和10 mg/ml）的樣品0.20 ml（對(duì)照用蒸餾水代替），并于25 ℃電熱恒溫水浴鍋中保溫10 min，加入同樣預(yù)溫的30 mmol/L的鄰苯三酚12 μl，混勻后精確反應(yīng)4 min，0.50 ml濃鹽酸終止反應(yīng)，在320 nm處測(cè)吸光度，以等體積pH為8.2的TrisHCl緩沖液作為空白，以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。清除能力T=（A對(duì)照-A樣品）/（A對(duì)照-A空白）×100%，式中，A空白為T(mén)risHCl緩沖液的吸光度值；A對(duì)照為T(mén)risHCl緩沖液+鄰苯三酚溶液（未多糖）的吸光度值；A樣品為多糖的吸光度值。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)從圖2可以看出，銅藻多糖提取率隨溫度升高先升高再降低，在70 ℃時(shí)提取率最高，達(dá)0.849 7%，在一定范圍內(nèi)，溫度升高有助于多糖滲出而溫度超出最佳條件后，其提取率呈下降趨勢(shì)；提取率隨料液比增加先升高后降低，在1∶20時(shí)，提取率最高。提取率隨提取時(shí)間的增加，逐漸升高，4 h后提取率略下降，從圖2可知提取時(shí)間對(duì)提取率的影響較顯著。

2.2正交試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，提取時(shí)間、溫度以及料液比3種因素對(duì)銅藻多糖提取效率的影響大小依次為C>A>B，即提取溫度>提取時(shí)間>料液比。銅藻多糖最佳提取工藝為A1B1C2，即提取時(shí)間3 h、提取溫度60 ℃、料液比1∶20 g/ml。

2.3抗氧化活性測(cè)定結(jié)果由圖3可見(jiàn)，在不同濃度下，銅藻多糖對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力，呈一定的濃度依賴性，濃度為10 mg/ml 時(shí)，其清除率達(dá)38.8%，低于陽(yáng)性對(duì)照組（Vc組）；水提法提取的銅藻多糖具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力，并與濃度呈正相關(guān)，濃度為8 mg/ml 時(shí)，多糖抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力最高，為48.1%，但低于陽(yáng)性對(duì)照組（Vc組為75.0%）；銅藻粗多糖有超氧自由基清除能力，濃度為10 mg/ml 時(shí)，其清除能力為34.2%，其超氧自由基清除能力隨濃度的增加而增強(qiáng)，但明顯低于Vc（清除能力為92.1%）。

3結(jié)論與討論

海藻具有陸生植物所不具備的生態(tài)條件，造就了其具有特殊分子結(jié)構(gòu)及生理、生化特性，其所含的多糖具有特殊的醫(yī)用功能，對(duì)治療人類的慢性疾病有顯著療效，因此開(kāi)發(fā)和利用海洋藻類代謝產(chǎn)物具有重大意義[15]。海藻多糖的提取工藝及其活性研究，主要集中在羊棲菜、海帶等藻類，銅藻多糖提取工藝及其體外抗氧化能力的相關(guān)研究報(bào)道不多，該研究分析了銅藻多糖提取條件，并對(duì)其主要影響因子（提取溫度、提取時(shí)間、料液比）進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，影響銅藻多糖提取率的主要因素為提取溫度和時(shí)間，料液比為其次，其最優(yōu)的提取工藝為：在料液比1∶20 g/ml、60 ℃下提取3 h。該方法（水提法）既節(jié)約成本又易于操作的藻類提取有效方法，具有提取工藝簡(jiǎn)單、能耗低、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，因而易于推廣到實(shí)際生產(chǎn)中，有望實(shí)現(xiàn)銅藻多糖提取的產(chǎn)業(yè)化。

該研究對(duì)銅藻多糖的DPPH自由基清除能力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力以及超氧陰離子（O-2）清除能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，該多糖在體外具有一定的抗氧化能力，其抗氧化能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，這與劉麗佳等采用酶法提取的銅藻多糖相比[16]，抗氧化活性有一定的增強(qiáng)，表明不同提取條件可能影響了多糖的活性，但較Vc弱，這有可能與其純度不高有關(guān)，需要進(jìn)行深入研究。通過(guò)對(duì)銅藻多糖提取工藝的優(yōu)化，并探討了其體外抗氧化能力，表明銅藻多糖具有一定的抗氧化能力，該試驗(yàn)為銅藻資源的研究和開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

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