胸水中SHOX2基因甲基化程度與肺癌的關系

【摘 要】 目的 本研究的目的是檢測胸水中SHOX2基因甲基化作為良惡性胸腔積液鑒別方法的臨床價值。方法 運用實時熒光定量PCR的方法分析亞硫酸氫鹽轉化后的胸腔積液中SHOX2基因是否存在甲基化。結果 共60例患者，其中惡性胸腔積液組28例，良性胸腔積液組19例，非肺部惡性腫瘤伴胸腔積液組13例，惡性胸腔積液組中35.7%（10/28）出現(xiàn)甲基化陽性，良性胸腔積液組發(fā)現(xiàn)甲基化為0%（0/19）。肺部惡性腫瘤組與良性組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。SHOX2基因甲基化診斷肺癌的敏感性為35.7%，特異性為100%。結論 胸腔積液中沉渣細胞SHOX2基因甲基化狀態(tài)是一種有潛力的鑒別胸腔積液良惡性的輔助診斷方法。

【關鍵詞】 SHOX2基因；胸腔積液； PCR；甲基化；肺癌

【中圖分類號】 R734.2 【文獻標識碼】 B

Relations Pleural Effusion SHOX2 Gene Methylation and Lung Cancer

Li Shaofei Nie Ligong

（Department of Respiratory Medicine，Peking University First hospital，Beijing，Xicheng，100034）

【Abstract】 Objective As a pleura effusion-based assay would expand the possible applications of the SHOX2 biomarker，this study aimed to develop a modified SHOX2 assay for use in a blood-based test and to analyze the performance of this optimized SHOX2 methylation assay in pleura effusion.Methods Quantitative real-time polymerase chain reaction was used to analyze DNA methylation of SHOX2 in pleura effusion samples from 25 individuals.Results Of the 60 patients with pleural effusion，28 had a definite diagnosis of malignant pleural effusion，and 19 were confirmed to have benign pleural effusion， 13 had a definite diagnosis of malignant tumor except lung cancer.The positivity rate of SHOX2 gene methylation was 35.7%（10/28）in malignant pleural effusion and 0%（0/19） in benign pleural effusion specimens， showing a significant difference between them （P<0.05）.The diagnostic sensitivity and specificity of shox2 gene in the 25 cases were 35.7% and 100%， respectively.Conclusion Detection of aberrant methylation in shox2 gene in the sediment cells of pleural effusion specimens allows differentiation between benign and malignant pleural effusion.

【Keywords】 shox2 gene；pleural effusion；PCR；methylation；lung cancer

肺癌是最常見腫瘤之一，據(jù)2010年我國第三次全國死因回顧分析顯示，我國肺癌的發(fā)病率及死亡率已躍居首位[1]，成為嚴重威脅人民健康的疾病之一。肺癌以胸腔積液為首發(fā)表現(xiàn)者并不少見，而在胸腔積液的鑒別診斷中，良惡性胸腔積液的鑒別是十分重要的方面。影像學可以發(fā)現(xiàn)肺部及胸膜異常，有助于鑒別胸腔積液病因，但其敏感性及特異性均不能滿足臨床實踐的需要[2]，最終需要胸腔積液細胞病理或組織病理證實。對于惡性胸腔積液，細胞病理學首次診斷敏感性為48.5%[3]；閉式胸膜活檢敏感性相比胸腔積液細胞病理學并無明顯優(yōu)勢；電視胸腔鏡（VATS），其診斷準確性在90%以上，而圍手術期死亡率小于0.5%，但是VATS需要全身麻醉及單肺通氣，相對禁忌癥較多[4]；內(nèi)科胸腔鏡經(jīng)過發(fā)展，其診斷準確性幾乎和VATS相同，其侵入性及并發(fā)癥更少，大有取代VATS之勢。但上述方法均為有創(chuàng)檢查，患者不但要經(jīng)歷痛苦，并且可出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥。

DNA甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，檢測某些DNA位點的甲基化可以作為腫瘤標志物，應用于腫瘤的診斷。最近研究發(fā)現(xiàn)，應用實時定量PCR技術檢測SHOX2基因甲基化程度可以用于肺癌的診斷。有研究證實通過檢測血漿或支氣管吸出液中SHOX2基因甲基化程度，有助于診斷肺癌，因此，我們試圖通過檢測胸水中的SHOX2甲基化程度以鑒別良惡性胸水。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集我院及北京大學腫瘤醫(yī)院2011年10月至2012年7月住院及門診患者胸腔積液，收集后于-20℃冰箱凍存標本。根據(jù)入選標準，選擇入組患者。

入組標準（1）肺惡性腫瘤組：曾經(jīng)或現(xiàn)在有組織學或細胞學病理證實。（2）良性胸腔積液組：a結核性胸腔積液：有抗酸桿菌病原學證據(jù)或胸腔積液為以單核細胞為主的滲出液，且ADA>45U/L，或經(jīng)抗結核治療，胸腔積液減少或消失。b漏出液同時伴心、肝、腎功能不全之一；c胸腔積液2月以上，隨訪未發(fā)現(xiàn)腫瘤證據(jù)。d炎性胸腔積液：多核細胞為主的滲出液，且抗生素治療后胸腔積液減少或消失。e胸腔鏡未發(fā)現(xiàn)腫瘤證據(jù)。（3）非肺部惡性腫瘤組：有明確細胞或組織學病理證實除肺或胸膜外其他部位腫瘤。

總共有60例患者入組，其中肺部腫瘤組28例（其中鱗狀細胞癌5例，腺癌16例，大細胞癌1例，小細胞癌3例，未知病理類型3例），良性胸腔積液組19例（結核性胸腔積液14例，炎性胸腔積液2例，漏出液3例），非肺部惡性腫瘤伴胸腔積液組13例（其中乳腺癌6例，卵巢癌2例，胸膜間皮瘤1例，右下肢近端惡性腫瘤1例，鼻咽癌1例，淋巴瘤1例，結腸癌1例）。三組之間年齡、性別無統(tǒng)計學差異。（見表1）

1.2 主要試劑 DNA提純應用OMEGA公司（貨號：D-3392）和QIAGEN公司（貨號：51104）試劑盒；DNA亞硫酸氫鹽轉化應用ZYMO RESEARCH公司（貨號：D5005）和QIAGEN公司（貨號：59104）試劑盒；甲基化陽性對照應用QIAGEN公司試劑盒（貨號：59655）；引物及探針由上海輝睿生物科技有限公司和北京諾賽基因有限公司合成；2×TAG PCR MIX為北京歐比特有限公司產(chǎn)品；實時熒光定量PCR儀器為Applied Biosystems7300 。

1.3 試驗方法

1.3.1 提純DNA 將胸腔積液標本常溫下解凍，應用DNA提取試劑盒提取DNA（具體參考試劑盒說明書）。應用UV分光光度計測定DNA濃度及純度，取濃度>5ng/ul且A260/280為1.6-2.0為合格樣本。

1.3.2 亞硫酸氫鹽轉化 將提純的DNA進行亞硫酸氫鹽轉化（具體參考試劑盒說明書）。

1.3.3 實時熒光定量PCR 采用雙重實時熒光定量PCR，β-actin作為陽性對照，采用20ulPCR反應體系，樣本加1ul，2×PCR Mix 10ul，其余不足體積用去離子水補齊，在實時熒光定量PCR儀擴增。PCR反應條件為95℃/10′，50個循環(huán)：95℃/15″，56℃/30″，72℃/30″。每個樣本重復兩次。（引物及探針序列見附錄）

1.3.4 判斷標準 在陽性對照、陰性對照、空白對照有效的情況下，樣本中β-actin和SHOX2基因均有指數(shù)擴增曲線為甲基化陽性，樣本中β-actin基因有指數(shù)擴增曲線，而SHOX2基因無擴增曲線為甲基化陰性。

1.3.5 統(tǒng)計分析 應用IBM SPSS Statistics19統(tǒng)計軟件， 基因表達與臨床診斷特征的關系采用四格表卡方檢驗， 以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 各組間甲基化檢出率差別（四格表卡方檢驗）

2.1.1 肺癌組與良性組 肺癌組者中10/28可檢測到甲基化，而良性組未發(fā)現(xiàn)甲基化，兩組間具有統(tǒng)計學差異（P=0.003），SHOX2基因甲基化在肺癌組與良性組相比，檢測敏感性35.7%，特異性100%。（見表2）

2.1.2 肺癌組與其他腫瘤組 其他腫瘤組中甲基化檢出率為23%（3/13），與肺癌組相比，兩組之間無統(tǒng)計學差異（P=0.493）。（見表3）

2.1.3 良性組與其他腫瘤組 良性組與其他腫瘤組中甲基化檢出率無統(tǒng)計學差異（P=0.058）。（見表4）

2.2 肺部惡性腫瘤組亞組分析 肺部惡性腫瘤組中，不同病理類型間甲基化檢出率無統(tǒng)計學差異（P=0.138）。（見表5）

3 討論

DNA甲基化在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。之前多個研究證實，將甲基化作為腫瘤標志物應用到腫瘤篩查中也起到了一定作用。最近新出現(xiàn)的SHOX2甲基化的研究表明其在腫瘤篩查方面具有較高的特異性及一定的敏感性。在選擇體液種類方面，主要有血漿及支氣管吸出液兩種。選用血漿的優(yōu)點是取材方便，可以作為廣泛篩查的工具，診斷肺癌的敏感性為60%，特異性達90%。缺點（1）血漿中腫瘤細胞相對量較少。（2）其他部位腫瘤細胞同樣可以釋放入血，特異性較差。選用支氣管吸出液的優(yōu)點是取材特異，不易混入其他腫瘤細胞，且腫瘤細胞量相對較多，其敏感性為68%，特異性達95%。缺點是侵入性操作，不可能成為大規(guī)模篩查工具[5，6]。本實驗選用胸腔積液作為標本，其優(yōu)點在于取材特異性更高，腫瘤細胞數(shù)量更多，可以作為鑒別良惡性胸腔積液的工具。缺點是惡性胸腔積液患者已是IV期，此檢查對于肺癌的早期診斷幫助不大。

從我們的結果上看，惡性胸腔積液組中10/28出現(xiàn)陽性，而非肺部惡性腫瘤組及良性胸腔積液組未見甲基化。診斷敏感性為35.7%，特異性為100%。肺癌導致的胸腔積液與良性胸腔積液具有統(tǒng)計學差異（P<0.05，F(xiàn)isher's Exact Test）。特異性與支氣管吸出液及血清中的結果一致，但是敏感性較差，胸腔積液中的SHOX2基因甲基化并沒有增加檢驗敏感性，可能與檢測方法不同有關。

目前研究甲基化的方法有多種，根據(jù)不同檢測方法的原理及其發(fā)展先后，大致可分為三類： （1）將DNA降解為單核苷酸而后采用化學分析儀器如液相色譜或質(zhì)譜對甲基化與非甲基化的胞嘧啶進行區(qū)分；（2）用序列特異性甲基化內(nèi)切酶使DNA部份降解，通過Southern印跡區(qū)分甲基化與非甲基化的相關序列；（3）利用亞硫酸氫鈉（BISULFITE）預處理DNA ，直接通過引物延伸反應或耦聯(lián)其他機制對甲基化與非甲基化的胞嘧啶進行區(qū)分[10]。

2004年德國Epigenomics AG公司采用了HeavyMethyl的新技術，即在實時熒光定量PCR檢測甲基化時引入了甲基特異化的blocker，而引物為非甲基特異性。此方法特異性極高，可擴增出30-60pg甲基化DNA，而無任何非甲基化DNA擴增[9]。目前已有商業(yè)試劑盒，暫未在中國銷售。

本實驗嘗試了這種新的甲基化研究方法HeavyMethyl分析方法。這種方法相對于傳統(tǒng)的MSP方法具有以下優(yōu)點[7]。（1）特異性高。MSP中，特異性主要取決于引物設計的特異性。如果在PCR初始循環(huán)中，MSP引物不適當?shù)慕Y合在非甲基化DNA上進行延伸，那么在其后的循環(huán)中此擴增產(chǎn)物及其互補產(chǎn)物將作為底物參與擴增。所以，MSP的特異性要求每個PCR循環(huán)中均無MSP引物錯配。而HeavyMethyl則不同。因為其甲基化特異性是blocker賦予的，而blocker是無法擴增的，故在PCR循環(huán)過程中，blocker始終保持初始濃度，發(fā)揮相同的作用效率。所以，理論上來說，隨著PCR循環(huán)次數(shù)的增多，HeavyMethyl的特異性越強，而MSP特異性越弱。（2）實驗設計靈活性增加。由于HeavyMethyl的引物和探針并不需要跨越CpG島，給了設計引物及探針更多的基因序列[8]。文獻報導其正常人中有少量甲基化，大約在0.04%（支氣管吸出物）、0.05%（血漿）以下，在50000pg非甲基化的SHOX2基因只能檢測出15-25pg的甲基化SHOX2基因。本實驗中應用了HeavyMethyl方法進行SHOX2基因的甲基化研究，在良性胸腔積液組中并未發(fā)現(xiàn)甲基化，與文獻有差異，可能原因是：（1）甲基化SHOX2基因絕對數(shù)量過少。由于收集標本的方法所限，試驗中使用的樣本并非新鮮樣本，一部分是在4℃冰箱中放置3天以上，未進行任何抗凝、防細胞破裂、防DNA降解、放細菌污染等措施，并且在提純DNA前需將胸水從-20℃解凍，其中必然會有細胞破裂及DNA降解，亞硫酸氫鹽轉化過程中，同樣有部分DNA被降解，由于良性胸腔積液中非甲基化SHOX2基因數(shù)量巨大，DNA降解對其并無實質(zhì)影響，而甲基化SHOX2基因數(shù)量極少，即使極少量甲基化SHOX2基因降解，就可能造成其數(shù)量偏少而無法進行有效擴增，造成良性胸腔積液檢測敏感性不足；而在惡性胸腔積液中，由于大量甲基化的腫瘤細胞脫落至胸腔積液中，降解部分可能尚不足以影響檢測，故有一定的檢出率。（2）檢測方法敏感性不足。一般來說，在實時熒光定量PCR中，濃度相差10倍，CT值大約差3.3（理想狀態(tài)），如果正常人甲基化程度在0.05%，那么甲基化SHOX2與非甲基化SHOX2基因濃度相差1000-10000倍，CT值相差大約9.9-13.2，本實驗中，良性胸水組內(nèi)參基因的CT值大部分在30左右，而由于在基因擴增過程中，隨著大量底物的消耗及Tag酶的失活，在PCR后期，可能反應條件不足以使甲基化PCR進行，故在良性胸腔積液組表現(xiàn)為假陰性。（3）樣本量少，代表性不足。

惡性胸腔積液最常見原因是肺部腫瘤，其次為乳腺癌[11]，同時卵巢癌、胃癌、淋巴瘤等均可導致惡性胸腔積液。在一項包括811個病例的薈萃分析顯示：惡性胸腔積液中，35%為肺癌，23%為乳腺癌[12]。其他部位腫瘤同時合并胸腔積液，胸腔積液原因可能為胸膜轉移，也可能為放化療過程中出現(xiàn)心肝腎損害導致的漏出液或炎性胸腔積液，本試驗中，13例非肺部惡性腫瘤中，3例出現(xiàn)甲基化，肺部惡性腫瘤組相比，無統(tǒng)計學差異，提示SHOX2可能并不僅僅在肺癌是易發(fā)生甲基化，在發(fā)生其他腫瘤時同樣也可能出現(xiàn)甲基化，對肺癌和其他癌的鑒別診斷價值不大；而與良性組相比，盡管無統(tǒng)計學差異，但p值接近0.05，可能與樣本量小有關，需要進一步研究。

對肺部惡性腫瘤組進行亞組分析，小細胞肺癌陽性率最高[13]，鱗癌次之，與文獻報道相一致，但統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)亞組之間無統(tǒng)計學差異，可能是由于病例數(shù)太少，今后需繼續(xù)擴大病例數(shù)以驗證是否與文獻一致。

據(jù)我們所知，這是第一個檢測胸水甲基化的研究，其局限性：（1）標本量少，以后需繼續(xù)收集樣本以進行大樣本研究。（2）標本均為放置一段時間之后，可能有DNA降解。（3）良性胸腔積液組隨診時間較短，尚需進一步隨診觀察，改進實驗方法，以提高敏感性。

4 結論

胸腔積液中沉渣細胞SHOX2 基因甲基化狀態(tài)是一種有潛力的鑒別胸腔積液良惡性的輔助診斷方法[14]。但與其他體液比較，并沒有增加檢測的敏感性，可能與試驗方法的敏感性不足有關，需要大樣本改進方法后或利用已上市試劑盒進行檢測。

致 謝

在收集標本過程中，得到了北京腫瘤醫(yī)院方建主任醫(yī)師、陳筱琳醫(yī)師的大力幫助，在此表示感謝。

參考文獻

[1] 陳萬青，張思維，鄒小農(nóng).中國肺癌發(fā)病死亡的估計和流行趨勢研究[J].中國肺癌雜志，2010，（05）.

[2] 樸憲偉.胸腔積液CT檢查的臨床意義[J].中國實用醫(yī)藥，2008，（13）.

[3] Bielsa S，Panades MJ，Egido R，Rue M，Salud A，Matias-Guiu X， etal.Accuracy of pleural fluid cytology in malignant effusions[J].An Med Interna，2008，25（4）：173-177.

[4] Neragi-Miandoab S.Malignant pleural effusion，current and evolving approaches for its diagnosis and management[J].Lung Cancer，2006，54（1）：1-9.

[5] Kneip C，Schmidt B，Seegebarth A，Weickmann S，F(xiàn)leischhacker M，Liebenberg V，etal.SHOX2 DNA methylation is a biomarker for the diagnosis of lung cancer in plasma[J].J Thorac Oncol，2011，6（10）：1632-1638.

[6] Schmidt B，Liebenberg V，Dietrich D，Schlegel T，Kneip C， Seegebarth A，etal.SHOX2 DNA methylation is a biomarker for the diagnosis of lung cancer based on bronchial aspirates[J].BMC Cancer，2010，10：600.

[7] Down TA，Rakyan VK，Turner DJ，F(xiàn)licek P，Li H，Kulesha E，etal. A Bayesian deconvolution strategy for immunoprecipitation-based DNA methylome analysis[J].Nat Biotechnol，2008，26（7）：779-785.

[8] Kneip C，Schmidt B，F(xiàn)leischhacker M，Seegebarth A，Lewin J， Flemming N，etal.A novel method for sensitive and specific detection of DNA methylation biomarkers based on DNA restriction during PCR cycling[J].Biotechniques，2009，47（3）：737-744.

[9] Cottrell SE， Distler J，Goodman NS，Mooney SH，Kluth A，Olek A，etal.A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers[J].Nucleic Acids Res，2004，32（1）：e10.

[10] 周翠蘭，殷宇芳，張佳，陳琳玲，肖莉，廖端芳，等.DNA甲基化的生物學意義及其檢測方法[J].南華大學學報（醫(yī)學版），2005，（02）.

[11] Lee YC，Yasay JR，Johnson JE，Parker RE，Thompson PJ，Lane KB， etal.Comparing transforming growth factor-beta2，talc and bleomycin as pleurodesing agents in sheep[J].Respirology，2002， 7（3）：209-216.

[12] Hausheer FH，Yarbro JW.Diagnosis and treatment of malignant pleural effusion[J].Semin Oncol，1985，12（1）：54-75.

[13] Toyooka S，Maruyama R，Toyooka KO，McLerran D，F(xiàn)eng Z， Fukuyama Y，etal.Smoke exposure，histologic type and geography-related differences in the methylation profiles of non-small cell lung cancer[J].Int J Cancer，2003，103（2）：153-160.

[14] Kim DH，Nelson HH，Wiencke JK，Zheng S，Christiani DC，Wain JC， etal.p16（INK4a） and histology-specific methylation of CpG islands by exposure to tobacco smoke in non-small cell lung cancer[J].Cancer Res，2001，61（8）：3419-3424.

附錄（引物及探針序列）

β-actin基因：

上游引物：5’-a g a t a g t g t t g t g g g t g t a g-3

下游引物：5’-c c t a c t a t a c a c c t a c t t a a t a c a c-3’

探針序列： 5’-HEX-t g t g a t a a g g t t a t g a g g t t g g t g t a-BHQ1-3’

SHOX2基因：

上游引物： 5’-g t t t t t t g g a t a g t t a g g t a a t-3’

下游引物：5’-c c t c c t a c c t t c t a a c c c-3’

Blocker 1： 5’-t a a t t t t t g t t t t g t t t g t t t g a t t g g g g t t g t a t g a-NH2-3’

Blocker2：5’-a c c c a a c t t a a a c a a c a a a c c c t t t a-NH2-3’探針序列： 5’-FAM-c t c g t a c g a c c c c g a t c g-BHQ1-3’