一次病原微生物質(zhì)控盲樣鑒定及結(jié)果分析

摘 要：目的 提高我縣疾病預(yù)防控制中心（CDC）對常見病原菌的檢測能力。方法 按照《衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗》何曉青著、GB/T4789、7-2008進(jìn)行檢驗。結(jié)果 質(zhì)控盲樣為副溶血性弧菌，且與致病性顯著相關(guān)。結(jié)論 鑒定結(jié)果及時、準(zhǔn)確。本實驗室常見病原菌的檢測能力進(jìn)一步鞏固和提高。

關(guān)鍵詞：病原微生物；質(zhì)控；盲樣；檢測能力

Identification and analysis on a blind samples of pathogenic microorganism quality control

FU cui-hua

Center for Disease Control and Prevention of Nanchang County ，JiangXi330200，China.

Abstract:Objective To improve the detection capability of common pathogenic bacteria of CDC in NanChang County.Method Conduct detection according to the sanitation and epidemic prevention bacteria inspection of the HeXiaoqing and GB/T4789、7-2008 .Result The blind sample is Vibio parahemolyticus，and it is highly correlated to pathogenicity.Conclusion The result of identification is just in time and accurate.The detection capability of common pathogenic bacteria had been consolidated and improved further.

Keyword: Pathogenic microorganism; Quality control; Blind sample;Detection capability

微生物質(zhì)控盲樣菌株鑒定既能考查微生物實驗室檢驗結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，又能快速提升檢測人員的業(yè)務(wù)技術(shù)水平[1]。為了保證所提供數(shù)據(jù)的公正、準(zhǔn)確和科學(xué)，我們每年定期參加南昌市CDC組織的盲樣考核，現(xiàn)將2012年11月的一次微生物盲樣考核情況及結(jié)果報告如下：

1 材料與方法

1.1 質(zhì)控盲樣

密封試管裝半固態(tài)斜面培養(yǎng)物1支。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

1.2.1 營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂、EMB瓊脂、WS瓊脂、TCBS瓊脂、TSA-YE瓊脂、三糖鐵（TSI）瓊脂、半固體瓊脂、氧化酶試劑均購自杭州天和微生物試劑有限公司；無菌綿羊全血購自杭州新銳；快速革蘭氏染色液和微生物生化鑒定試劑盒購自康泰生物；副溶血性弧菌生化鑒定管（11種×10支）由杭州微生物試劑有限公司提供。上述培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2.2 3%Nacl堿性蛋白胨水、嗜鹽培養(yǎng)基、我妻氏血瓊脂、Hugh-Leifson二氏培養(yǎng)基由實驗室自制。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)菌種

本次質(zhì)控使用的標(biāo)準(zhǔn)菌種：ATCC29213金黃色葡萄球菌、ATCC25922大腸埃希氏菌、ATCC9027銅綠假單胞菌。

1.5 按BSL-2級實驗室生物安全防護(hù)要求進(jìn)行盲樣接種。

1.6 儀器設(shè)備型號名稱（廠家）

GSP-9270MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、Nikon E200雙目生物顯微鏡（上海雙旭電子有限公司）

1.7 檢驗方法

組織單位發(fā)放微生物盲樣考核作業(yè)指導(dǎo)書、《衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗》[2]、GB/T4789、7-2008[3]。

2 菌株鑒定思路與過程

2.1認(rèn)真閱讀微生物盲樣考核作業(yè)指導(dǎo)書，按照要求進(jìn)行操作作業(yè)指導(dǎo)書要求按GB4789進(jìn)行檢測。

2.2 肉眼觀察未知菌斜面生長情況未知菌斜面生長良好、濕潤、呈無色半透明，無蔓延生長現(xiàn)象。

2.3 革蘭氏染色G-菌，呈桿狀、卵圓狀等。

2.4 氧化酶試驗氧化酶試驗陽性。

2.5 接種3支高層半固體和4支營養(yǎng)瓊脂斜面，以觀察細(xì)菌動力、保存菌種及獲取生化鑒定所需的足夠的菌量。同時接種Hugh-Leifson二氏培養(yǎng)基、TSI瓊脂、營養(yǎng)肉湯、3%Nacl堿性蛋白胨水、營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂、EMB瓊脂、WS瓊脂、TCBS瓊脂、TSA-YE瓊脂于36.5℃恒溫培養(yǎng)24h。結(jié)果見表1.

2.6 嗜鹽性試驗0%（-）、3%（++++、表層形成菌膜）、6%（++）、8%（+）、10%（-）

2.7 確定鑒定

2.7.1副溶血性弧菌生化鑒定管（11種×10支）結(jié)果見表2。

注1.培養(yǎng)基均含3.5%Nacl。2.鳥氨酸于36.5℃恒溫培養(yǎng)至第4天出現(xiàn)陽性結(jié)果

表1 培養(yǎng)基生長情況及菌落形態(tài)特征

2.7.2 革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒:按照試劑說明進(jìn)行操作，結(jié)果見表3。

表 3

2.8 神奈川(KP)試驗

KP試驗陽性：點(diǎn)種菌落周圍呈現(xiàn)窄的半透明的β溶血環(huán)。

3 結(jié)果

3.1 由2.1~2.5提示質(zhì)控盲樣可能為副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus，Vp）。

3.2 結(jié)合2.1~2.8，該質(zhì)控盲樣為Vp，且與致病性顯著相關(guān)。

4 討論

盲樣考核是實驗室室間質(zhì)控和能力驗證的主要內(nèi)容之一，在盲樣鑒定過程中，我們要利用所有對我們有用的資料，每一步都應(yīng)用常識來判斷[4]，大膽提出假設(shè)并按照現(xiàn)行有效的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗證。

在鑒定工作中第一步是得到每個有機(jī)體的純培養(yǎng)，簡單的細(xì)菌或真菌的最初分類是以形態(tài)學(xué)性質(zhì)結(jié)合生理學(xué)性質(zhì)特別是對氧的需求和利用碳水化合物（特別是對葡萄糖）的方式為基礎(chǔ)的[4]。在常見病原菌的分離中，革蘭氏染色、糖代謝試驗、氧化酶試驗/觸酶試驗、有無動力即可將盲樣鑒定到科或?qū)賉2]。本次盲樣為G-桿菌、氧化酶陽性、糖代謝為發(fā)酵性、有動力，綜合這4點(diǎn)即可將質(zhì)控盲樣定為弧菌科或氣單胞菌科。仔細(xì)閱讀組織單位發(fā)放的微生物盲樣考核作業(yè)指導(dǎo)書，了解到病原菌的檢測標(biāo)準(zhǔn)范圍為GB4789，再根據(jù)培養(yǎng)基生長情況及菌落形態(tài)特征，我們即可以假定質(zhì)控盲樣為副溶血性弧菌，能后按照GB/T4789、7-2008[3]進(jìn)行鑒定并驗證假設(shè)，結(jié)果及時、準(zhǔn)確。

細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性和質(zhì)量控制有著直接的關(guān)系[5-6]，此外，細(xì)菌學(xué)檢測的方式方法也很重要。嗜鹽性試驗作為弧菌屬鑒定的初步試驗，在接種時，用接種針挑取菌落，很難控制不同Nacl濃度嗜鹽管的接種量，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性。而用滅菌移液器向每個濃度嗜鹽管中接種10~20μl營養(yǎng)肉湯過夜培養(yǎng)物（稀釋成相當(dāng)于0.5號麥?zhǔn)瞎軡舛龋?，這種方法操作簡單，觀察結(jié)果時準(zhǔn)確且不同Nacl濃度嗜鹽管混濁度具有可比性。

Vp所產(chǎn)生的耐熱直接溶血毒素(thermostabile direct hemolysin，TDH)，被認(rèn)為是Vp的一種主要的毒力因子[7]，由于編碼TDH的基因高度表達(dá)而產(chǎn)生“神奈川現(xiàn)象”[8]。本次質(zhì)控盲樣Vp試驗陽性，因而與致病性顯著相關(guān)[3、9] 。在考核結(jié)束后，對鑒定過程中所產(chǎn)生的任何廢棄物均經(jīng)121℃，15-20分鐘高壓消毒無害化處理。

定期對實驗室開展質(zhì)量控制考核是實驗室能力驗證計劃的類型之一，也是計量認(rèn)證和國家實驗室認(rèn)可的特定要求[10]。質(zhì)控盲樣的鑒定過程，就是一個對檢驗人員、儀器設(shè)備、檢測方法的選擇、培養(yǎng)基和試劑，原始記錄規(guī)范書寫的一個全方位的驗證過程，通過對國家標(biāo)準(zhǔn)的仔細(xì)閱讀與操作，使檢驗人員對常見病原菌的檢測能力進(jìn)一步鞏固和提高。同時也增強(qiáng)了自信，以更好的應(yīng)對常見病原菌的食物中毒。

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作者簡介：

付翠華（1973-），女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事病原微生物檢驗工作。