熒光定量PCR檢測(cè)社區(qū)獲得性肺炎患者咽拭和痰標(biāo)本肺炎支原體的研究

摘 要：目的 了解熒光定量PCR用于檢測(cè)成人社區(qū)獲得性肺炎患者肺炎支原體意義。方法：對(duì)50例社區(qū)獲得性肺炎患者痰和咽拭及27例無(wú)呼吸道感染健康人痰進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)肺炎支原體DNA。結(jié)果：健康人27例中8例PCR陽(yáng)性，CAP患者中45例留痰標(biāo)本，其中27例做PCR，全部陽(yáng)性，咽拭49例，36例陽(yáng)性。以健康人痰中DNA含量高值為感染閾值，最后確定感染比例50%。結(jié)論：健康人中上呼吸道存在肺炎支原體DNA，而熒光定量PCR可以作為肺炎支原體檢測(cè)方法且檢測(cè)時(shí)間短。

關(guān)鍵詞：社區(qū)獲得性肺炎；熒光定量PCR；肺炎支原體；咽拭子；痰

Abstract：ObjectiveTo know the value of flurescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) that detect the Macoplasma pneumonia of the patiant who are the community acquired pneumonia. Method A total of 50 patients with community-acquired pneumoniae and the heathy control group 27 persons whose respiratory secretion will be check by flurescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR).Result:Eight of 27 persons in the group is positive .There are 45 persons who generate sputums，27do the flurescence quantitative polymerase chain reaction ，and all are posive. The swab are 49 ，and 36 are posive.Ti is the standard that make sure which is affected by the MP.The threshold is the top of the the health people respiratory secretion quility of the MP DNA.The rate of infection is 50%.Conclusion:There are MP DNA in the upper respiratory tract of the health people.The flurescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) is a fast and valubale mean to test the DNA of MP.

KeyWords : Fluorescence quantitative polymerase chain reaction；Community acquired pneumoniae；Mycoplasma pneumoniae；Sputum；Swab

肺炎支原體（MP）是社區(qū)獲得性肺炎重要病原體，所占比例大約10-30%，并呈持續(xù)增加的趨勢(shì)，且目前應(yīng)用最廣泛的β內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)肺炎支原體無(wú)效，大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類雖然對(duì)肺炎支原體敏感，然而在亞洲地區(qū)肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥率非常高超過50%，而耐喹諾酮的肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌比例也在增加，因此在社區(qū)獲得性肺炎治療中，聯(lián)合應(yīng)用抗生素越來(lái)越多。肺炎支原體快速診斷非常重要。

然而肺炎支原體傳統(tǒng)診斷方法主要是血清學(xué)—IgM或IgG雙份血清滴度升高4倍為診斷標(biāo)準(zhǔn)，多用于回顧性診斷，且診斷特異性和敏感性易受免疫力低下和近期患肺炎支原體感染影響。分子生物學(xué)是近十幾年來(lái)發(fā)展最迅速學(xué)科之一，其核酸擴(kuò)增技術(shù)非常成熟，已應(yīng)用于肺炎支原體診斷。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）就是其中之一，如今在傳統(tǒng)PCR技術(shù)上出現(xiàn)了更先進(jìn)PCR技術(shù)，如熒光定量PCR，熒光定量PCR是集PCR高敏感性、DNA雜交探針的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量為一體，它一般2小時(shí)內(nèi)出結(jié)果，為臨床早診斷早治療提供幫助。但肺炎支原體是否是正常人呼吸道定值菌一直存在爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)以正常人呼吸道分泌物及社區(qū)獲得性肺炎患者痰及咽拭標(biāo)為本，對(duì)標(biāo)本中肺炎支原體DNA進(jìn)行定量分析，檢驗(yàn)正常人呼吸道是否存在肺炎支原體定植，同時(shí)對(duì)肺炎支原體肺炎患者進(jìn)行標(biāo)本中肺炎支原體DNA定量。

1. 材料與方法：

1.1 研究對(duì)象：

2009年5月——2010年1月入住我院呼吸科50例社區(qū)獲得性肺炎病人（診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2006年我國(guó)CAP指南標(biāo)準(zhǔn)），其中男24例，女26例，年齡15-82歲。對(duì)照組：男14例，女13例，年齡19-75歲，近3個(gè)月無(wú)呼吸道感染的健康志愿者。

1.2 方法：

1.2.1 標(biāo)本采集：

咽拭：用無(wú)菌拭子擦拭咽后壁，然后浸入1ml無(wú)菌生理鹽水?dāng)嚥⒂昧D壓管壁，低倍鏡下計(jì)數(shù)并記錄，保存-80度冰箱用以PCR檢測(cè)。

痰：收集入院時(shí)痰標(biāo)本，低倍鏡檢是否合格，保存-80度冰箱待檢。

對(duì)照組只采取咳出的呼吸道分泌物，保存-80度冰箱待檢。

1.2.2 PCR過程：

咽拭按肺炎支原體定量PCR試劑盒（試劑盒購(gòu)于深圳匹基生物有限公司）說(shuō)明進(jìn)行操作，患者痰及健康組呼吸道分泌物先用4%氫氧化鈉消化，而后按試劑盒說(shuō)明操作。

2. 統(tǒng)計(jì)方法：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。咽拭的急性期和恢復(fù)期運(yùn)用配對(duì)t檢驗(yàn)；痰和咽拭陽(yáng)性率采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；在肺炎支原體感染組與非肺炎支原體感染組院前抗生素應(yīng)用、性別、年齡、血沉、影像學(xué)、血白細(xì)胞等臨床特征比較采用卡方和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；對(duì)照組采用統(tǒng)計(jì)描述；p<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3. 結(jié)果：

咽拭49例，陽(yáng)性36例，陽(yáng)性率73.5%，定量8.48×106±1.48×107copies/ml，

痰熒光定量PCR檢測(cè)24例，陽(yáng)性率100%，痰MP定量5.94×109±1.51×1010copies/ml。

對(duì)照組MP陽(yáng)性率26.9%，MP量范圍0-1.43×106copies/ml，MP感染患者定義為痰DNA大于等于107copies/ml，CAP患者M(jìn)P感染率為51%。

4. 討論：

肺炎支原體是目前了解最小的可以在非細(xì)胞培養(yǎng)基上生長(zhǎng)微生物。由于其DNA含量小，不能形成細(xì)胞壁，故對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素不敏感，同時(shí)其在CAP中比例越來(lái)越大，因此倍受重視。但對(duì)于正常人上呼吸道是否有肺炎支原體定植存在爭(zhēng)議，以往認(rèn)為攜帶率為0-13%[1]，但另一些實(shí)驗(yàn)認(rèn)為正常人呼吸道不存在肺支原體，如瑞典在一個(gè)肺炎支原體爆發(fā)流行地區(qū)，隨機(jī)選取237名學(xué)生，年齡在10-16歲（此年齡段易發(fā)肺炎支原體感染）范圍，無(wú)任何呼吸道感染癥狀體征。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，標(biāo)本咽拭，只有一例陽(yáng)性，數(shù)天后該患出現(xiàn)呼吸道癥狀，應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類藥物后好轉(zhuǎn)，在隨訪中發(fā)現(xiàn)肺炎支原體存在時(shí)間長(zhǎng)短不一，最長(zhǎng)達(dá)7月，半數(shù)超過50天，如果這部分人再出現(xiàn)呼吸道感染，很難區(qū)分是否為肺炎支原體感染，如果能定量也許可以區(qū)分。我們實(shí)驗(yàn)表明有26.9%正常對(duì)照組存在肺炎支原體DNA，而對(duì)照組近3個(gè)月未發(fā)生呼吸道感染，我們認(rèn)為正常人呼吸道存在肺炎支原體。

在對(duì)患者標(biāo)本分析發(fā)現(xiàn)痰標(biāo)本中肺炎支原體全部陽(yáng)性，咽拭陽(yáng)性率73.5%，如不定量很難想象全部病人為支原體感染，而且正常對(duì)照組中有26.9%為陽(yáng)性，其中最高肺炎支原體DNA 含量達(dá)1.43×106copies/ml，故我們以肺炎患者痰標(biāo)本中肺炎支原體DNA量大于等于107copies/ml為感染最低值，在確定肺炎支原體感染病人中咽拭最低值以上為肺炎支原體感染，即DNA≥105copies/ml，肺炎支原體總感染率為51%。感染率高于國(guó)內(nèi)相關(guān)研究及通常認(rèn)為肺炎支原體感染率20%左右[2]。這可能因?yàn)榈貐^(qū)差別，在不同地區(qū)、時(shí)間和人群中發(fā)病率各不相同，多數(shù)研究認(rèn)為發(fā)病率約10-20% [3]，但在爆發(fā)地區(qū)肺炎支原體占CAP病原體可高達(dá)65%[4]。我們研究發(fā)現(xiàn)在這段時(shí)間來(lái)我院住院社區(qū)獲得性肺炎患者，肺炎支原體感染病例比例較大，推測(cè)可能這段時(shí)間處于流行時(shí)節(jié)，或者本地區(qū)肺炎支原體感染比例原本比其他地區(qū)偏高，且在正常人呼吸道發(fā)現(xiàn)肺炎支原體DNA。

我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常人上呼吸道存在肺炎支原體DNA，但卻沒有任何全身及呼吸道癥狀如發(fā)熱、咳嗽等，不僅正常人，一些受到肺炎支原體感染患者用藥后癥狀緩解但肺炎支原體DNA仍存在，如美國(guó)紐約一個(gè)肺炎支原體爆發(fā)流行地區(qū)，給PCR和培養(yǎng)陽(yáng)性病人阿奇霉素口服3-5天癥狀緩解，3-6周再查咽拭8/73PCR陽(yáng)性，3/22培養(yǎng)陽(yáng)性[5]。這表明肺炎支原體可以無(wú)癥狀存在人呼吸道，是呼吸道定植微生物。故應(yīng)用PCR檢測(cè)呼吸道標(biāo)本肺炎支原體需要定量。我們研究正常對(duì)照組人數(shù)偏少，如能針對(duì)不同季節(jié)對(duì)較大規(guī)模人群進(jìn)行檢測(cè)呼吸道肺炎支原體DNA，可以得出本地區(qū)正常人群攜帶肺炎支原體DNA量作為感染閾值，可以作為診斷肺炎支原體感染方法。

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