VEGF—C和VEGFR—3在宮頸增生性病變活檢組織中的表達(dá)及其意義

【摘 要】 目的 觀(guān)察VEGF-C及其受體VEGFR-3在宮頸增生性病變活檢組織中的表達(dá)情況，探討其與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以期成為早期判斷宮頸癌有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要參考指標(biāo)。方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)51例宮頸鱗癌組織活檢中VEGF-C 、VEGFR-3蛋白表達(dá)情況，同時(shí)采用15例宮頸炎性、修復(fù)性增生組織；44例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織（CIN）做為對(duì)照。結(jié)果 VEGF-C與VEGFR-3在宮頸炎性、修復(fù)性增生組織，CIN及宮頸鱗癌活檢組織中的表達(dá)依次增高，三者相比，P<0.05，在宮頸鱗癌活檢組織中，VEGF-C與VEGFR-3的表達(dá)陽(yáng)性率淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P<0.05）。結(jié)論 VEGF-C和VEGFR-3在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，有望作為早期判斷有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要參考指標(biāo)之一，為臨床早期干預(yù)治療提供可靠實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 宮頸增生性病變；活檢組織；VEGF-C；VEGFR-3

【中圖分類(lèi)號(hào)】 R711.74 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 BThe Significance and Expression of VEGF-C and VEGFR-3 in Biopsy of Cervical Lesions

Liu Cuiyun Wang Meiling Zhang Chunmei Cheng Hui Chen Weijuan Tian Xiucheng

262700，Department of Pathology，Peopie Hospital of shouguang，Shandong（Liu Cuiyun，Wang Meiling，Chenghui，ChenWeijuan）

262700，Shouguang Hospital for Maternal and Child Health Care，shandong shouguang （Zhang Chunmei）

262700，The Centers for Disease Control and Prevention of shouguang city，Shandong，shouguang（Tian Xiucheng）

【Abstract】 Objective To study the expression of VEGF-C and VEGFR-3 that its receptor in biopsy of cervical lesions，to explore its relationship with occurrence，development and lymph node metastasis of cervical cancer，to become an important reference index for early judgment of cervical cancer with or without lymph node metastasis.Methods Immunohistochemistry was used to test the expression of the VEGF-C and VEGFR-3in 51 cases of cervical squamous cell carcinoma tissue，and at the same time，15 cases of cervical epithelial，inflammmatory and reparative hyperplasia tissue and 44 cases of cervical intraepithelial neoplasia （CIN） tissue were used to be the control.Results The expression of VEGF-C and VEGFR-3 is increasing with the progress of the disease， the difference is significant comparing with eath other （P<0.5）.In the group of cervix squamous carcinoma biopsy tissues with lymph node metastasis，the positive expression rate of VEGF-C and VEGFR-3 was significantly higher than that in the group without lymph node metastasis （P<0.5）.Conclusion VEGF-C and VEGFR-3 plays an important role in occurrence， development and transfer process of cervical squamous cell carcinoma and is expected as an important index in early judgment if there is lymph node metastasis， provides a reliable experimental basis for the clinical treatment of early intervention

【Keywords】 cervical Hyperplasia；biopsy Tissue；VEGF-C；VEGFR-3

宮頸癌在女性生殖道腫瘤中居首位，其病因、發(fā)病機(jī)理、病程發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制目前尚不明確。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生，其成員VEGF-C可與其受體VEGFR-3結(jié)合，介導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化和淋巴管的增生。近年針對(duì)腫瘤抗血管生成的靶向治療已用于臨床并取得較好療效，在腫瘤的發(fā)展中淋巴管生成是淋巴轉(zhuǎn)移的重要途徑，通過(guò)對(duì)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究表明，阻斷VEGFR-3與VEGF-C 的結(jié)合將成為治療腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)[1]。本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)宮頸炎性、修復(fù)性增生組織，宮頸上皮內(nèi)瘤變（逐級(jí)CIN）及宮頸鱗癌活檢組織中VEGF-C 和VEGFR-3的表達(dá)情況。探討其在宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用，以期在宮頸活檢標(biāo)本中對(duì)早期判斷宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，為臨床早期干預(yù)治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集壽光市人民醫(yī)院2009年6月-2011年3月間宮頸活檢標(biāo)本111例，其中宮頸炎性、修復(fù)性增生組織15例；宮頸上皮內(nèi)瘤變組織44例（CINI 10例，CINII 16例，CINIII 18例）；宮頸鱗癌組織51例（患者年齡21-82歲，平均51.2歲）。后經(jīng)宮頸癌根治手術(shù)切除證實(shí)。根據(jù)2000年FIGO制定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期I期24例，Ⅱ期17例，Ⅲ期10例；按組織學(xué)分級(jí)，高分化鱗癌13例，中、低分化鱗癌38例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例；術(shù)前均無(wú)放療和化療史。

1.2 試劑 VEGF-C抗體為兔抗人多克隆抗體（稀釋度為1：150）；VEGFR-3抗體為兔抗人多克隆抗體，免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化方法 將通過(guò)中性福爾馬林固定，石蠟包埋處理的宮頸活檢標(biāo)本連續(xù)切片三張，厚度為4um。采用SP免疫組化染色方法，熱修復(fù)，抗原修復(fù)液為PH6.0的檸檬酸緩沖液，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，經(jīng)DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色后，中性樹(shù)膠封片，具體步驟從略。用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 （1）VEGF-C的著色以胞漿呈棕黃色顆粒為準(zhǔn)，分布相似。根據(jù)Beeasley免疫染色評(píng)分方法，按陽(yáng)性細(xì)胞所見(jiàn)百分比并參考著色強(qiáng)度判斷分級(jí)。無(wú)明顯著色陽(yáng)性細(xì)胞為（-），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%為（+），25%-50%為（++），>50%為（+++）。（2）VEGFR-3陽(yáng)性為脈管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。VEGFR-3脈管判斷標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)數(shù)方法，低倍鏡下尋找VEGFR-3陽(yáng)性脈管密集區(qū)，即熱區(qū)，100倍視野計(jì)數(shù)5個(gè)熱區(qū)中VEGFR-3陽(yáng)性脈管數(shù)取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)量變量資料均以（x±s）表示，采用X2檢驗(yàn)，兩指標(biāo)間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，所有數(shù)據(jù)處理都采用雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C在宮頸病變中的表達(dá) 在宮頸炎性、修復(fù)性增生中不表達(dá)或偶見(jiàn)少量表達(dá)。在CINI中有3例表達(dá)（+-++），在CINII中有4例表達(dá)（++-+++），在CINIII中的50%左右的表達(dá)（++-+++），在宮頸癌組織中有超過(guò)60%的表達(dá)（++-+++）。（見(jiàn)圖1和圖2）VEGF-C蛋白表達(dá)在逐級(jí)宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的表達(dá)中存在顯著性差異（P<0.01）

2.2 VEGFR-3在宮頸病變組織中的表達(dá) VEGFR-3的表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞周邊的脈管內(nèi)，在腫瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜中也存在少量表達(dá)。（見(jiàn)圖3和圖4）在病變由炎性修復(fù)性增生向?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變質(zhì)宮頸癌的發(fā)展過(guò)程中VEGFR-3陽(yáng)性脈管數(shù)逐漸增加。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中看出，宮頸鱗癌的淋巴管生成從CINⅡ開(kāi)始出現(xiàn)，CINⅢ中開(kāi)始顯著表達(dá)，各組宮頸病變比較均有顯著性差異（P<0.05）。在宮頸鱗癌組織中，在VEGF-C表達(dá)中隨著其強(qiáng)度增加，VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性的脈管數(shù)也明顯增加，而V在EGF-C陰性表達(dá)中VEGFR-3陽(yáng)性脈管數(shù)減少，利用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。VEGFR-3的表達(dá)與VEGF-C呈中度正相關(guān)（rs=0.736 P<0.01）。VEGF-C、VEGFR-3在宮頸病變組織中的表達(dá)（見(jiàn)表1）。

2.3 VEGF-C、VEGFR-3的表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系（表2）。

3 討論

目前臨床對(duì)宮頸鱗癌的治療方法包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療以及各種治療方法的綜合應(yīng)用。并針對(duì)患者的不同病期其治療方案隨之調(diào)整。在臨床診斷為Ib-Ⅱ期及以上的宮頸鱗癌中約有38%的患者在根治術(shù)后隨配合放、化療但仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，治療失敗與腫瘤的浸潤(rùn)深度和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Van等通過(guò)研究認(rèn)為淋巴管的新生系由VEGF-C 激活其受體VEGFR-3所引起[2]。VEGF-C表達(dá)于人體的部分組織和實(shí)體瘤細(xì)胞中，與其它VEGF家族成員具有同源性，誘導(dǎo)淋巴管的發(fā)生，并通過(guò)激活淋巴內(nèi)皮細(xì)胞膜上的VEGFR-3來(lái)促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和淋巴管擴(kuò)張，VEGF-C與VEGFR-3在胞外去結(jié)合后，使VEGFR-3胞內(nèi)區(qū)酪氨酸自動(dòng)鱗酸化，通過(guò)一系列信號(hào)傳導(dǎo)，激活Pas-MAPK 途徑，啟動(dòng)DNA復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞的分裂和增殖[3]，從而促進(jìn)淋巴管或血管生成[4]。Skobe等[5]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-C可誘導(dǎo)腫瘤組織周?chē)湍[瘤內(nèi)部形成新的淋巴管，并可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移。

已有大量研究表明腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段、多基因參與過(guò)程，近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C和宮頸鱗癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，LeuAJ等[8]認(rèn)為腫瘤淋巴管主要位于癌旁組織，而腫瘤組織內(nèi)不存在淋巴管；Van Trappen[2]等研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的淋巴生成可能發(fā)生在CINIII階段，臨床治療中對(duì)CINIII需采取積極措施。王向紅[6]等研究顯示，VEGF-C與VEGFR-3有望作為判斷宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)之一?？赏ㄟ^(guò)阻斷VEGF-C及其受體的相互作用而抑制宮頸鱗癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。但Baldwin 等有不同發(fā)現(xiàn)，VEGF-C缺陷的基因突變鼠生長(zhǎng)健康，沒(méi)有發(fā)病。本研究結(jié)果顯示：在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展的不同階段中VEGF-C與VEGFR-3的表達(dá)存在差異。在CINI、CINⅡ和CINⅢ之間差異顯著（P<0.01），而CINⅢ級(jí)與浸潤(rùn)型鱗癌之間無(wú)顯著性差異，研究發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌的淋巴管生成可能從CINⅡ開(kāi)始出現(xiàn)，重點(diǎn)發(fā)生在CINⅢ級(jí)階段；在宮頸鱗癌組織中VEGFR-3陽(yáng)性脈管數(shù)與VEGF-C高表達(dá)呈正相關(guān)，說(shuō)明宮頸鱗癌細(xì)胞分泌的VEGF-C能激活其受體VEGFR-3達(dá)到表達(dá)狀態(tài)，并與之結(jié)合誘發(fā)淋巴管的生成，促進(jìn)宮頸鱗癌的淋巴轉(zhuǎn)移，從而降低患者的生存時(shí)間和生存率，應(yīng)及早干預(yù)，與Van Trappen等的報(bào)道一致。

在宮頸鱗癌的表達(dá)中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的VEGF-C與VEGFR-3的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，說(shuō)明VEGF-C在宮頸鱗癌中既促進(jìn)淋巴管生成也促進(jìn)血管的生成。VEGFR-3表達(dá)的陽(yáng)性脈管數(shù)還與宮頸侵襲深度呈顯著正相關(guān)。表明阻斷VEGFR-3信號(hào)通路可抑制腫瘤淋巴管生成及淋巴管轉(zhuǎn)移。Shimizu等[7]成功在鼠胃癌模型用抗VEGFR-3抗體阻斷了原發(fā)胃癌局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，降低了原發(fā)瘤的淋巴管密度。

研究表明腫瘤組織中淋巴管形成及淋巴管浸潤(rùn)在宮頸鱗癌轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中起著重要作用，現(xiàn)在腫瘤的抗血管生成的靶向治療已用于臨床并取得了較好的療效，隨著腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)一步闡明，阻斷VEGFR-3與VEGF-C結(jié)合，可能成為治療宮頸鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。對(duì)宮頸鱗癌的治療意義重大。本研究結(jié)果顯示：VEGF-C和VEGFR-3有望作為在宮頸增生性病變活檢標(biāo)本中早期監(jiān)測(cè)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)之一，為臨床早期干預(yù)治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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