使用多位點(diǎn)變異重復(fù)序列（MLVA）法分析臨床樣本中豬肺炎支原體的分子類型

中圖分類號(hào)：S855 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2014）02-0007-01

1 緒論

豬肺炎支原體（M. hyopneumoniae）是豬地方性肺炎的病原體，也是造成全球養(yǎng)豬生產(chǎn)損失的病因之一。多項(xiàng)研究報(bào)道，豬群中流行的豬肺炎支原體有多種毒株。因而急需要一種定型方法，以評(píng)估豬肺炎支原體的暴發(fā)、了解其致病機(jī)理和流行病學(xué)，同時(shí)評(píng)估控制該病的干擾措施。因此，本研究的目的是為豬肺炎支原體毒株鑒別方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，研究在美國(guó)豬群中流行的豬肺炎支原體的遺傳多樣性。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

本實(shí)驗(yàn)以6個(gè)月內(nèi)送交至美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室的210份臨床樣本為研究對(duì)象。樣本使用DNeasy血液和組織診斷試劑盒提取純的基因組DNA。通過(guò)調(diào)整先前制定的分析方法，對(duì)多位點(diǎn)變異重復(fù)序列分析（Multilocus Variable Number Tandem Repeat Analysis，MLVA）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。該方法分析2份豬肺炎支原體附著因子蛋白（P97和P146 ）重復(fù)位點(diǎn)數(shù)量。熒光標(biāo)記引物加入遞減式PCR反應(yīng)中，以擴(kuò)增目標(biāo)位點(diǎn)。使用瓊脂糖凝膠電泳以確定擴(kuò)增子大小。每份樣本取10 μL，以1∶32的比例進(jìn)行稀釋，隨后提交至伊利諾伊大學(xué)進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。未能通過(guò)毛細(xì)管電泳分析的樣本需利用標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，并且為分析中的添加物進(jìn)行人工計(jì)數(shù)重復(fù)位點(diǎn)。使用BioNumerics（Version 7.0）軟件分析MLVA模型。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)粒度范圍和染色情況，兩位點(diǎn)在電泳圖中可以得到清楚的鑒定，并按照重復(fù)位點(diǎn)的數(shù)值轉(zhuǎn)化為分類值。該分析的辛普森（Simpson）多樣性指數(shù)為：P97，D=0.908；P146，D=0.929；當(dāng)2個(gè)基因位點(diǎn)組合在一起時(shí)，D=0.908。對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)組合后進(jìn)行的分析顯示，本研究所有樣本共有87種MLVA模型；其中最常見的模型是MLVA 9-26型（7.2 %），隨后分別是MLVA 15-25型（6.2 %）、MLVA 15-21型（5.2 %）、MLVA 11-15型（4.7 %）和MLVA 14-21型（4.3 %）。分析表明，明尼蘇達(dá)州的107份樣本有54種MLVA模型；其中，最常見的模型是MLVA 15-23型（12.2 %），隨后順次為MLVA 15-21型（10.3 %）， MLVA 8-7型（6.5 %）。根據(jù)地理位置，未發(fā)現(xiàn)有簇的存在。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)了大量的MLVA模型，這表明在美國(guó)豬群和美國(guó)國(guó)家水平上流行著多種豬肺炎支原體變異體。對(duì)從不同地區(qū)和不同疾病類型中縱向收集到的樣本有必要作進(jìn)一步的分析，以研究基因型的非隨機(jī)分布是否存在于高致病性菌株間?！酢?/p>

原題名：Molecular typing of Mycoplasma hyopneumoniae in clinical samples using MLVA（英文）

原作者：V Neira-Ramirez，M Torremorell，P Rabinowitz，B Paccha和S Gibbs