蟲草素對(duì)糖毒性胰腺INS-1E細(xì)胞保護(hù)作用*

趙海燕，陳立波，黎麗萍，黃 興，李 靜，胡園園，呂術(shù)昕

（深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院，深圳 518052）

2型糖尿病是以高血糖為首發(fā)特征的代謝障礙性疾病，與基因和環(huán)境因素密切相關(guān)[1]。胰島素是機(jī)體唯一降低血糖的激素，主要由胰腺β細(xì)胞分泌。當(dāng)β細(xì)胞的數(shù)量減少和功能受到損傷，不能適應(yīng)環(huán)境變化分泌適量的胰島素時(shí),血糖就會(huì)升高。持續(xù)高血糖可直接損害β細(xì)胞影響其功能，引起β細(xì)胞分泌胰島素能力減弱和β細(xì)胞凋亡[2-3]，進(jìn)而加重血糖升高形成惡性循環(huán),這種現(xiàn)象稱之為葡萄糖毒性[4]。蟲草素是從蛹蟲草中分離提取出的單體，屬于腺苷類化合物，具有多種藥理作用和生物效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)蟲草素具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[5]，這些結(jié)果提示蟲草素可能是一個(gè)多靶點(diǎn)的化合物，目前國內(nèi)關(guān)于蟲草素對(duì)糖尿病的治療研究鮮有報(bào)道，本文初步探討蟲草素對(duì)胰腺β細(xì)胞在高糖毒性下的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑 蟲草素購買于美國Sigma公司；胎牛血清（批號(hào) 16000-044）、RPMI1640（批號(hào)22240089）購于美國Gibco公司；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（批號(hào)20160412）購于北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司；Akt（批號(hào) sc-8312），p-Akt（批號(hào) sc-4060s）和 β-actin（批號(hào) sc-47778）抗體 購于美國Santa Cruz公司，辣根過氧化酶標(biāo)記鼠二抗(鼠抗兔IgG）（批號(hào)ZB2305）購買于北京中杉金橋公司，顯影液購買于美國Millipore公司，胰島素酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）試劑盒購于美國Salem公司，INS-1E胰島細(xì)胞株購于協(xié)和細(xì)胞資源庫。

1.2 儀器 TECAN GENios pro酶標(biāo)儀（瑞士）；電子天平（德國Sartorius公司，型號(hào)BS124S）倒置顯微鏡（中國重慶光電儀器有限公司，型號(hào)XDS-1B）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化公司，型號(hào)SW-CJ-2D）；純水儀（英國 ELCA，型號(hào) Ultra-Genetics）；水套式 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermoforma公司，型號(hào)3111），垂直電泳儀（美國Biorad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CCK-8法檢測(cè)INS-1E細(xì)胞增殖活性 按照CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒說明書測(cè)定各組細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞懸液（1×105/mL）按 100 μL/孔的量加入96孔板中（邊緣孔用無菌水填充），高糖（30 mmol/L葡萄糖）環(huán)境下培養(yǎng)，每孔加入含蟲草素終濃度分別為 6.25、12.5、25 μmol/L 的培養(yǎng)液，用只含有溶媒的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，每個(gè)劑量組做7復(fù)孔，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8試劑10 μL/孔，在培養(yǎng)箱孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長的吸光度值。

細(xì)胞存活率（%）=A（加藥）－A（空白）/A（0加藥）－A（空白）×100

2.2 ELISA法檢測(cè)胰島素分泌和合成 對(duì)數(shù)生長期的INS-1E細(xì)胞以8×104個(gè)/孔接種于24孔板中，分別用低糖（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖（30 mmol/L葡萄糖）和高糖+25 μmol/L蟲草素培養(yǎng)3 d后，先用無糖的 KRB[包括（mmol/L）：135 NaCl，3.6 KCl，1.5 CaCl2，0.5 MgCl2，0.5 NaH2PO4，5 NaHCO3，10 HEPES及0.1%BSA，pH=7.4]緩沖液平衡1 h，再用含16.8mmol/L葡萄糖的KRB緩沖液刺激30min，分別收集上清和細(xì)胞，用ELISA試劑盒檢測(cè)上清和細(xì)胞中胰島素的量，并用相應(yīng)的細(xì)胞蛋白量進(jìn)行量化。

2.3 蛋白免疫印跡法（Western-blot）檢測(cè)蛋白表達(dá) INS-1E細(xì)胞相應(yīng)處理培養(yǎng)4 d后，用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒定量，每組取等量蛋白（30 μg/lane）的樣品進(jìn)行電泳。完成電泳后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電流為300 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為60 min。完成轉(zhuǎn)膜后，置于封閉液含5%（W/V）的脫脂奶粉TBST溶液中，室溫，封閉1 h。封閉結(jié)束后，用TBST洗滌膜一次，時(shí)間5 min。將待檢測(cè)蛋白與用TBST稀釋的一抗4℃冰箱過夜。一抗作用結(jié)束后，用TBST洗滌3次。將一抗相應(yīng)的結(jié)合有辣根過氧化物酶的二抗按1∶5 000稀釋后，室溫作用1 h。二抗作用完成后，洗滌膜3次，利用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色。

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組資料之間比較采用單因素方差分析；兩兩比較采用LSD法，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 高糖毒性對(duì)INS-1E細(xì)胞胰島素分泌的影響 將胰島INS-1E細(xì)胞分別在低糖（5.5 mmol/L葡萄糖）和高糖（30 mmol/L葡萄糖）環(huán)境下培養(yǎng)3 d，用無糖的KRB緩沖液平衡1 h，再用含2.8 mmol/L或16.8 mmol/L葡萄糖的KRB緩沖液刺激30 min，用ELISA檢測(cè)胰島素分泌情況，發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)后INS-1E細(xì)胞對(duì)糖刺激的胰島素分泌顯著降低（P<0.05），甚至對(duì)葡萄糖刺激失去反應(yīng)性，而在低糖環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞在葡萄糖的刺激下胰島素正常分泌，見表1。

4.2 蟲草素對(duì)高糖毒性INS-1E細(xì)胞增殖保護(hù)作用 將胰腺INS-1E細(xì)胞在高糖（30 mmol/L葡萄糖）環(huán)境下，同時(shí)給予濃度分別為6.125、12.5、25 μmol/L的蟲草素進(jìn)行處理3 d后，用CCK-8試劑盒測(cè)量細(xì)胞增殖情況并計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果提示，單純高糖毒性抑制胰腺細(xì)胞增殖，蟲草素能夠保護(hù)高糖毒性下胰腺INS-1E促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞的存活率（P<0.01），見表2。

表1 高糖毒性對(duì)胰腺INS-1E細(xì)胞胰島素分泌的影響（x±s）Tab.1 Insulin secretion of pancreas INS-1E cell under glucotoxicity（x±s）

表2 蟲草素對(duì)糖毒性胰腺INS-1E細(xì)胞存活率作用（x±s）Tab.2 Survival effect of Cordycepin on glucotoxicity pancreas INS-1E cell（x±s）

4.3 蟲草素對(duì)糖毒性INS-1E細(xì)胞促胰島素釋放作用 將胰腺INS-1E細(xì)胞在高糖（30 mmol/L葡萄糖）環(huán)境下，同時(shí)給予濃度為25 μmol/L的蟲草素進(jìn)行處理3 d后，用ELISA試劑盒測(cè)量細(xì)胞上清液胰島素的含量，結(jié)果提示，在高糖毒性的環(huán)境下，蟲草素能夠促進(jìn)胰腺細(xì)胞分泌胰島素（P<0.01），見表3。

表3 蟲草素促進(jìn)糖毒性胰腺INS-1E細(xì)胞分泌胰島素作用（x±s）Tab.3 Insulin secretion of Cordycepin on glucotoxicity pancreas INS-1E cell（x±s）

4.4 蟲草素促進(jìn)糖毒性INS-1E細(xì)胞胰島素合成作用 將胰腺INS-1E細(xì)胞在高糖（30 mmol/L葡萄糖）環(huán)境下，同時(shí)給予濃度為25 μmol/L的蟲草素進(jìn)行處理3 d后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，用ELISA試劑盒測(cè)量總蛋白胰島素的含量，結(jié)果提示，在高糖毒性的環(huán)境下，蟲草素能夠促進(jìn)胰腺細(xì)胞合成胰島素（P<0.01），見表 4。

表4 蟲草素促進(jìn)糖毒性胰腺INS-1E細(xì)胞合成胰島素作用（x±s）Tab.4 Insulin synthesis of Cordycepin on glucotoxicity pancreas INS-1E cell（x±s）

4.5 蟲草素促進(jìn)糖毒性INS-1E細(xì)胞Akt磷酸化作用 胰腺INS-1E細(xì)胞用不同濃度的蟲草素處理2 h，收集細(xì)胞提取總蛋白，用Western-blot檢測(cè)Akt磷酸化，發(fā)現(xiàn)蟲草素能夠增加Akt磷酸化水平，并具有濃度依賴性，見圖5A。將胰腺INS-1E細(xì)胞分別在低糖（5.5 mmol/L葡萄糖）和高糖（30 mmol/L葡萄糖）環(huán)境下培養(yǎng)3 d，同時(shí)在高糖環(huán)境下給予濃度為25 μmol/L的蟲草素進(jìn)行處理，收集細(xì)胞，提取總蛋白，結(jié)果提示，蟲草素能夠促進(jìn)糖毒性INS-1E細(xì)胞Akt磷酸化作用，見圖5B。

圖5 蟲草素促進(jìn)糖毒性INS-1E細(xì)胞Akt磷酸化作用Fig.5 Akt phosphorylation of Cordycepin on glucotoxicity pancreas INS-1E cell

5 討論

糖尿病的發(fā)生是多因素造成的結(jié)果，或因β細(xì)胞本身原因引起的胰島素合成和分泌不足，或因分泌的胰島素在體內(nèi)不能正常發(fā)揮作用。在引起糖尿病的眾多因素中，其持續(xù)的高血糖對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷，引起β細(xì)胞的功能下降和調(diào)亡，進(jìn)而引起胰島素的合成和釋放減少，是其中一個(gè)重要因素，這種高糖引起的β細(xì)胞的損傷稱為糖毒性[6]，近年研究表明2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展與葡萄糖毒性所致β細(xì)胞數(shù)量減少和功能障礙有著密切的關(guān)系[7]。本文研究表明，在高糖環(huán)境下，蟲草素能夠減少糖毒性對(duì)胰腺INS-1E細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞的存活率，同時(shí)，糖毒性能夠引起胰腺INS-1E細(xì)胞對(duì)胰島素的合成和釋放減少，蟲草素能夠在糖毒性條件下促進(jìn)胰腺INS-1E細(xì)胞對(duì)胰島素的合成和釋放，蟲草素在細(xì)胞水平上能夠保護(hù)糖毒性對(duì)胰腺β細(xì)胞損傷作用。

Akt/PKB是一類非常重要的促進(jìn)細(xì)胞存活的蛋白激酶。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，有3種非常保守的由不同基因編碼的 Akt異構(gòu)體：PKBα/Akt1，PKBβ/Akt2及PKBγ/Akt3[4]，3種異構(gòu)體在β細(xì)胞均有表達(dá)[8]。Akt在細(xì)胞內(nèi)的作用非常廣泛，Akt磷酸化后可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡[9-13]，并且Akt磷酸化后能夠使轉(zhuǎn)錄因子FoxO1磷酸化促進(jìn)其從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位至胞漿從而促進(jìn)胰島素生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（PDX-1）的入核，繼而增加胰島素基因的轉(zhuǎn)錄[14-17]，促進(jìn)胰島素的合成。雖然Akt調(diào)控胰島素分泌的機(jī)制還不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)Akt可以調(diào)節(jié)控制β細(xì)胞葡萄糖敏感性和代謝的蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（GLUT2）和葡萄糖激酶（GCK）的表達(dá)[18-19]。此外，研究表明Akt可以調(diào)控胰島素囊泡胞吐相關(guān)的SNARE（syntaxin-1、SNAP25、VAMP2）蛋白的表達(dá)[11]；在轉(zhuǎn)基因鼠的胰島內(nèi)過表達(dá)組成性磷酸化Akt可以促進(jìn)胰島素分泌，并且可以抵抗鏈脲霉素誘發(fā)的糖尿病[14]。相反，抑制Akt的磷酸化后β細(xì)胞分泌胰島素明顯減少[18]，這些結(jié)果提示Akt能夠調(diào)節(jié)β細(xì)胞胰島素分泌。此外，有研究表明Akt活性在胰島素抵抗和2型糖尿病患者體內(nèi)顯著降低[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，蟲草素在胰腺INS-1E細(xì)胞上能夠促進(jìn)Akt的磷酸化，活化Akt，并具有劑量依賴性，在糖毒性的環(huán)境下能夠抑制胰腺INS-1E細(xì)胞的Akt磷酸化，經(jīng)蟲草素處理后能夠促進(jìn)Akt磷酸化，進(jìn)而推測(cè)蟲草素對(duì)糖毒性胰腺INS-1E細(xì)胞的保護(hù)作用可能與促進(jìn)Akt的磷酸化，激活A(yù)kt有關(guān)，為進(jìn)一步研究蟲草素保護(hù)糖毒性損傷的胰島細(xì)胞機(jī)制奠定了初步的科學(xué)依據(jù)。

[1]Peng D,Wang J,Zhang R,et al.CDKAL1 rs7756992 is associated with diabetic retinopathy in a Chinese population with type 2 diabetes[J].Sci Rep,2017,7(1):8812-8824

[2] Jia C,Chen H,Wei M,et al.Gold nanoparticle-based miR155 antagonist macrophage delivery restores the cardiac function in ovariectomized diabetic mouse model[J].Int J Nanomedicine,2017,12:4963-4979.

[3] Huang CN,Wang CJ,Lee YJ,et al.Active subfractions of Abelmoschus esculentus substantially prevent free fatty acidinduced β cell apoptosis via inhibiting dipeptidyl peptidase-4[J].PloSone,2017,12(7):e0180285.

[4] Zou HH,Yang PP,Huang TL,et al.PLK2 plays an essential role in high D-glucose-induced apoptosis,ROS generation and inflammation in Podocytes[J].Sci Rep,2017,7(1):4261.

[5] Hwang JH,Park SJ,Ko WG,et al.Cordycepin induces human lung cancer cell apoptosis by inhibiting nitric oxide mediated ERK/Slug signaling pathway[J].Am J Cancer Res,2017,7(3):417-432.

[6] Katsura T,Kawamori D,Aida E,et al.Glucotoxicity induces abnormal glucagon secretion through impaired insulin signaling in InR1G cells[J].PloSone,2107,12(4):e0176271.

[7] Quinault A,Gausseres B,Bailbe D,et al.Disrupted dynamics of F-actin and insulin granule fusion in INS-1 832/13 beta-cells exposed toglucotoxicity:partial restoration by glucagon-like peptide 1[J].Biochim Biophys Acta,2016,1862(8):1401-1411.

[8] Moeinifard M,Hassan ZM,Fauabian F,et al.Britannin induces apoptosis through AKT-FOXO1 pathway in human pancreatic cancer cells[J].Biomed Pharmacother,2017,94:1101-1110.

[9] Xue M,Ji X,Xue C,et al.Caspase-dependent and caspaseindependent induction of apoptosis in breast cancer by fucoidan via the PI3K/AKT/GSK3β pathway in vivo and in vitro[J].Biomed Pharmacother,2017(94):898-908.

[10]Li Y,Liu J,Yang X,e tal.Ginkgol C17:1 inhibits tumor growth by blunting the EGF-PI3K/Akt signaling pathway[J].J Biomed Res,2017,31(3):232-239.

[11]Lynda E,Norman B,Ernesto BM.Emerging role of protein kinase B/Akt signaling in pancreatic β-cell mass and function[J].The International Journal of Biochemistry&Cell Biology,2006,38(5-6):689-695.

[12]Chen L,Liu C,Gao J,et al.Inhibition of miro1 disturbs mitophagy and pancreatic β-cell function interfering insulin release via IRSAkt-Foxo1 in diabetes[J].Oncotarget,2017,8(53):90693-90705.

[13]Purvis SD,Chiazza F,Chen J,et al.Annexin A1 attenuates microvascular complications through restoration of Akt signalling in a murine model of type 1 diabetes[J].Diabetologia,2018,61(2):482-495.

[14]Buteau J,Spatz ML,Accili D.Transcription factor FoxO1 mediates glucagon-like peptide-1 effect sonpancreati cB-cell mass[J].Diabetes,2006,55(5):1190-1196.

[15]Lyer S,Han L,Ambroqin E,et al.Deletion of FoxO1,3,and 4 in osteoblast progenitors attenuates the loss of cancellous bone mass in a mouse model of type 1 diabetes[J].J Bone Miner Res,2017,32(1):60-69.

[16]Lee HY,Youn SW,Cho HJ,et al.FOXO1 impairs whereas statin protectsendothelialfunction in diabetesthrough reciprocal regulation of Kruppel-like factor 2[J].Cardiovasc Res,2013,97(1):145-52.

[17]Kluth O,Mirhashemi F,Scherneck S,et al.Dissociation of lipotoxicity and glucotoxicity in a mouse model of obesity associated diabetes:role of fork head box O1(FOXO1)in glucose-induced beta cell failure[J].Diabetologia,2011,54(3):605-15.

[18]Kim MK,Shin HM,Jung H,et al.Comparison of pancreatic beta cells and alpha cells under hyperglycemia:Inverse coupling in pAkt-FoxO1[J].Diabetes Res Clin Pract,2017,131:1-11.

[19]Yi L,Wei C,Fan W.Fine-particulate matter(PM2.5),a risk factor for rat gestational diabetes with altered blood glucose and pancreatic GLUT2 expression[J].Gynecol Endocrinol,2017,33(8):611-616.

[20]Mackenzie RW,Elliott BT.Akt/PKB activation and insulin signaling:anovel insulin signaling pathway in the treatment of type 2 diabetes[J].DiabetesMatebSyndrObes,2014,2014(default):55-64.