專(zhuān)利方四妙君逸軟膏促愈機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究*

劉 鈺，何永恒

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸科，長(zhǎng)沙 410005）

專(zhuān)利方四妙君逸軟膏（以下簡(jiǎn)稱(chēng)專(zhuān)利方）來(lái)源于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院著名專(zhuān)家何永恒教授的經(jīng)驗(yàn)方，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出該方的最佳配比，利用現(xiàn)代技術(shù)提取該方的有效部位，采取最優(yōu)成型工藝制成的一種外用于肛腸病術(shù)后的止痛促愈中藥復(fù)方，并在此基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)多次工藝改良制成現(xiàn)在的專(zhuān)利藥膏——四妙君逸軟膏（專(zhuān)利號(hào)：ZL2012103028669）[1-4]。在前期研究中本課題組發(fā)現(xiàn)該藥膏除具鎮(zhèn)痛作用外還兼一定的促愈[5-8]作用，但其具體作用機(jī)制不明，值得進(jìn)一步研究，現(xiàn)將本研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠90只，雄性，體質(zhì)量（260～280）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[合格證號(hào)：scxk（湘）2011-0003]，飼養(yǎng)于本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2 藥品、試劑與儀器 專(zhuān)利方四妙君逸軟膏（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室制備提供，批號(hào)：20150321）；卡波姆基質(zhì)軟膏（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室制備提供，批號(hào)：20150115）；重組人表皮生長(zhǎng)因子凝膠（中國(guó)桂林華諾威基因藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20140604）；龍珠軟膏（馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：141104）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（TGF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（南京建成科技有限公司，批號(hào)：BPE10963B 201511）；白介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：1151151522）；表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20151126）。HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海南陽(yáng)儀器有限公司）；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Motic B5顯微攝像圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）；OLYMPUS BX43型雙目生物攝像顯微鏡（日本產(chǎn)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的制備 將90只大鼠按每只3 mL/kg的劑量標(biāo)準(zhǔn)將水合氯醛注射入腹腔內(nèi)進(jìn)行麻醉。麻醉成功后，在大鼠的背部，腰椎正中偏上用電動(dòng)剃刀剃毛備皮，面積約7 cm×4 cm大小。脫毛處常規(guī)消毒，鋪無(wú)菌單，選擇背中部脊柱兩側(cè)各旁開(kāi)1 cm，距肩腳骨以下2 cm處制備創(chuàng)面，用創(chuàng)傷制作器切割2個(gè)直徑為18 mm圓形創(chuàng)面，深達(dá)皮下深筋膜層，形成機(jī)械創(chuàng)傷動(dòng)物模型[9]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 按隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的90只SD大鼠分為5組，每組18只，每只大鼠背部2個(gè)創(chuàng)面，統(tǒng)一以右側(cè)創(chuàng)面為給藥組，左側(cè)為自身對(duì)照組，每日統(tǒng)一上午8點(diǎn)至9點(diǎn)換藥1次，其中模型組不予任何藥膏，空白對(duì)照組予卡波姆基質(zhì)軟膏（2．6 g/kg），重組人表皮生長(zhǎng)因子組予重組人表皮生長(zhǎng)因子凝膠（2．6 g/kg），龍珠軟膏組予龍珠軟膏（2．6 g/kg），專(zhuān)利方組予專(zhuān)利方（2．6 g/kg）。每組內(nèi)再隨機(jī)均分為3組，于造模后第7、14天分別處死每個(gè)大組里的第1、2組大鼠，剩下第3組大鼠一直觀察右側(cè)創(chuàng)面至完全上皮化。

1.3.3 宏觀整體水平觀察不同時(shí)相點(diǎn)大鼠創(chuàng)面愈合情況 每次換藥時(shí)將大鼠置于預(yù)設(shè)裝置上固定，揭去敷料后，碘伏消毒傷口周緣，取固定距離處垂直于傷口拍攝帶標(biāo)尺傷口圖片，采用Image J1．48軟件（美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院）處理圖片，計(jì)算傷口面積[10]。再根據(jù)創(chuàng)面愈合率=（原創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原創(chuàng)面面積×100%計(jì)算各組大鼠術(shù)后第7天和第14天的創(chuàng)面愈合率。觀察記錄大鼠右側(cè)創(chuàng)面完全上皮化的最終時(shí)間。用蘇木精-伊紅染色法（HE染色法）觀察大鼠的病理組織愈合情況，并結(jié)合改良細(xì)化的病理組織學(xué)愈合標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表3）[11]給各組大鼠創(chuàng)面愈合情況評(píng)分，最后用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法定量分析其創(chuàng)面愈合情況。

1.3.4 微觀分子水平觀察不同時(shí)相點(diǎn)大鼠創(chuàng)面的愈合情況 用免疫組化法測(cè)大鼠背部創(chuàng)面肉芽組織中EGFR的表達(dá)。用ELISA法測(cè)大鼠血清中TGF-α和IL-1β濃度。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示,完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料滿(mǎn)足正態(tài)性和方差齊性后采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用LSD法；P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1 宏觀整體水平對(duì)不同時(shí)相點(diǎn)大鼠創(chuàng)面愈合情況的觀察結(jié)果

2.1.1 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 各組大鼠右側(cè)創(chuàng)面愈合率的比較，見(jiàn)表1。重組人表皮生長(zhǎng)因子組在第7和14天創(chuàng)面愈合率最大，且與專(zhuān)利方組和龍珠軟膏組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），而專(zhuān)利方組與龍珠軟膏組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

表1 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠右側(cè)創(chuàng)面愈合率（x±s）Tab.1 Healing rate of right-sidedness wound surface ondifferent time in each group of rats（x±s）%

2.1.2 各組大鼠背部創(chuàng)面最終愈合時(shí)間比較 重組人表皮生長(zhǎng)因子組創(chuàng)面愈合時(shí)間最短，專(zhuān)利方組次之，但兩者之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表 2。

表2 各組大鼠創(chuàng)面最終愈合時(shí)間（x±s）Tab.2 Ultimate healing time of wound surface in each group of rates（x±s）

2.1.3 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠背部創(chuàng)面組織病理學(xué)愈合情況比較 目前常用的組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)較簡(jiǎn)單，總值較小[11]，不適合對(duì)多個(gè)組別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)多重比較，因此本研究在此標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上結(jié)合肛腸病術(shù)后創(chuàng)面愈合特點(diǎn)將各個(gè)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)細(xì)化，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3。

表3 創(chuàng)面組織病理學(xué)評(píng)分表分Tab.3 Score tab of wound surface histopathology

3個(gè)治療組間比較總體趨勢(shì)為重組人表皮生長(zhǎng)因子組得分最高，專(zhuān)利方組次之，龍珠軟膏組最低。其中第7天專(zhuān)利方組與重組人表皮生長(zhǎng)因子組以及龍珠軟膏組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。第14天專(zhuān)利方組與重組人表皮生長(zhǎng)因子組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），與龍珠軟膏組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表 4、圖 1。

表4 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)評(píng)分比較（x±s）Tab.4 wound surface histopathology scores on differenttime in each group of rats（x±s） 分

2.2 微觀分子水平對(duì)不同時(shí)相點(diǎn)大鼠創(chuàng)面愈合情況的檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中EGFR含量 第7天和14天專(zhuān)利方組與重組人表皮生長(zhǎng)因子組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）,與龍珠軟膏組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表 5、圖 2。

2.2.2 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血清中TGF-α含量比較 第7天專(zhuān)利方組與重組人表皮生長(zhǎng)因子組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），與龍珠軟膏組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；第 14天專(zhuān)利方組與重組人表皮生長(zhǎng)因子組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），與龍珠軟膏組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表6。

2.2.3 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血清中IL-1β含量比較 第7天專(zhuān)利方組與重組人表皮生長(zhǎng)因子和龍珠軟膏組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。第14天各組大鼠血清中IL-1β顯色不明顯，未檢測(cè)到。見(jiàn)表7。

3 討論

從創(chuàng)面愈合率、愈合時(shí)間和病理組織學(xué)觀察等宏觀觀察指標(biāo)結(jié)果可知專(zhuān)利方具有良好的促愈作用，且作用與龍珠軟膏相當(dāng)。雖然專(zhuān)利方組創(chuàng)面上皮化速度未及表皮生長(zhǎng)因子組快，但是肉芽組織增長(zhǎng)速度較快。這符合肛腸病術(shù)后創(chuàng)面要求肉芽組織的生長(zhǎng)快于表皮生長(zhǎng)的特點(diǎn)，否則容易形成死腔影響愈合。

圖1 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織不同時(shí)相點(diǎn)愈合情況 HE染色（10×）Fig.1 Healing situation of granulation tissue of wound surface on different time in each group of rats（10×）

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,許多研究認(rèn)為創(chuàng)面愈合是一個(gè)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子相互協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜過(guò)程[12]。生長(zhǎng)因子在創(chuàng)傷修復(fù)和組織再生方面的作用已得到證實(shí)[13-15]，其中EGFR可刺激組織細(xì)胞增殖、分化、遷移，促進(jìn)新生肉芽組織形成和傷口的再上皮化,加速多種組織的創(chuàng)傷愈合[16]。因此，在創(chuàng)面愈合過(guò)程中EGFR是組織再生的一個(gè)基本調(diào)節(jié)者，其作用非常重要。而TGF-α是EGFR的配體家族成員之一，被證實(shí)在促進(jìn)創(chuàng)面愈合再生方面具有比表皮生長(zhǎng)因子（EGF）更大的效能[17]。本實(shí)驗(yàn)中5組大鼠肉芽組織中的EGFR受體均在第7天表達(dá)最多，密度最高，這與有報(bào)道人的燒傷創(chuàng)面中EGFR表達(dá)第7天達(dá)到峰值[18]的研究結(jié)果相似。TGF-α的趨勢(shì)同EGFR，說(shuō)明TGF-α與EGFR受體表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，提示本研究中的專(zhuān)利方可能是通過(guò)提高TGF-α與EGFR受體的結(jié)合產(chǎn)生促愈機(jī)制。

表5 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織切片中EGFR灰度值（x±s）Tab.5 EGFR Gradation of granulation tissue blade of wound surface on different time in each group of rats（x±s）

表6 不同時(shí)相點(diǎn)各組創(chuàng)傷大鼠血清中TGF-α濃度（x±s）Tab.6 TGF-α concentration of wound rats blood serum ondifferent time in each group of rats（x±s）pg/mL

圖2 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織不同時(shí)相點(diǎn)EGFR含量免疫組化圖片（40×）Fig.2 Immunohistochemisty of EGFR content of granulation tissue of wound surface on different time in each group of rats（40×）

表7 第7天各組IL-1β濃度值（x±s）Tab.7 Il-1β concentration of the 7th day in each group of rats（x±s）pg/mL

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)專(zhuān)利方的鎮(zhèn)痛機(jī)制與炎癥因子有關(guān)[8]，細(xì)胞因子能刺激靶細(xì)胞分裂增殖和各種組織修復(fù)，增加細(xì)胞外基質(zhì)合成，在創(chuàng)傷和大面積燒傷創(chuàng)面的修復(fù)重建中起著重要的作用，本研究結(jié)果提示專(zhuān)利方的促愈機(jī)制與其能夠減少早期炎癥因子IL-1β以及提高生長(zhǎng)因子TGF-α的表達(dá)有關(guān)。因此推測(cè)專(zhuān)利方的止痛促愈機(jī)制與其抗炎機(jī)制有關(guān)。因此，專(zhuān)利方四妙君逸軟膏能通過(guò)提高蛋白含量，上調(diào)生長(zhǎng)因子TGF-α和EGFR的表達(dá)水平，降低炎癥因子IL-1β濃度，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

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