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    生肌象皮膏對(duì)糖尿病潰瘍大鼠Ang/Tie-2通路的影響*

    2018-03-02 07:25:01朱子昭李巧芬
    天津中醫(yī)藥 2018年2期
    關(guān)鍵詞:生肌肉芽潰瘍

    劉 鵬 ,朱子昭 ,常 柏 ,李巧芬

    (1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193;2.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院,天津 300050)

    糖尿病在中國(guó)的患病率快速增長(zhǎng),成年人患病率已達(dá)11.6%,更嚴(yán)重的是中國(guó)約有45%的糖尿病患者未被診斷[1]。糖尿病對(duì)患者生命及生活質(zhì)量最大的威脅來(lái)自其并發(fā)癥。長(zhǎng)期高血糖可導(dǎo)致大血管及微血管動(dòng)脈粥樣硬化,伴有下肢血管病變的患者如果發(fā)生急、慢性損傷出現(xiàn)皮膚破潰,則會(huì)引發(fā)糖尿病足病,這是糖尿病患者住院率最高的疾病。糖尿病足的主要治療手段為清創(chuàng)、控制感染、改善局部血液循環(huán),必要時(shí)需截肢[2],糖尿病難愈性潰瘍的修復(fù)是困擾臨床醫(yī)生乃至整個(gè)內(nèi)分泌界的難題。中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有生肌長(zhǎng)皮作用的外用藥多種多樣,生肌象皮膏是其中代表之一,目前多用于治療各種感染傷口、慢性潰瘍及糖尿病足[3]。本課題組既往的研究已經(jīng)證明,生肌象皮膏可以加速糖尿病大鼠難治性潰瘍創(chuàng)面的愈合;可以增加表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶的含量;增加早期纖維連接蛋白的含量;能增加胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體的表達(dá)。生肌象皮膏可以在一定程度上抑制終末糖基化產(chǎn)物及受體的產(chǎn)生,隨時(shí)間的延長(zhǎng),更為明顯,促進(jìn)糖尿病潰瘍的愈合[4-7],對(duì)治療糖尿病難治性潰瘍有著良好的臨床效果[8]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)酪氨酸激酶受體-2(Tie-2),血管緊張素Ⅰ(Ang-1)及血管緊張素Ⅱ(Ang-2)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)觀察,進(jìn)一步揭示生肌象皮膏促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合的可能機(jī)制。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠,雄性,清潔級(jí),28日齡,體質(zhì)量(102.83±4.10)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 生肌象皮膏、凡士林、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇均購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室;鏈脲佐菌素(STZ),產(chǎn)自美國(guó)Sigma公司;超純RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)試劑盒、5x RNA Loading Buffer,均產(chǎn)自TaKaRa公司。Real-Time PCR檢測(cè)目的基因引物,見(jiàn)表1。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 羅氏血糖儀及試紙條,產(chǎn)自羅氏診斷產(chǎn)品有限公司;3K30型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),產(chǎn)自美國(guó)Sigma公司;Bio Tek Synergy2多功能酶標(biāo)儀,產(chǎn)自美國(guó)Bio-Te K公司;Bio-Rad電泳儀,產(chǎn)自美國(guó)Bio-Rad公司。

    表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 造模及分組 健康SD大鼠120只,均為雄性,在適應(yīng)性常規(guī)飼料喂養(yǎng)1周后按體質(zhì)量、血糖分層,隨機(jī)分為2組,分別為空白對(duì)照組20只,糖尿病組100只。糖尿病組大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)8周,經(jīng)尾靜脈注射小劑量STZ的方法制備糖尿病模型,剔除糖尿病大鼠造模過(guò)程中死亡及未成模的大鼠。1周后經(jīng)過(guò)尾靜脈注射苯巴比妥麻醉,在背部后側(cè)用打孔器打直徑為2.5 cm的孔,深度傷及筋膜層,并及時(shí)止血及無(wú)菌紗布包扎,以制備潰瘍模型,剔除死亡及未成模大鼠。剩余隨機(jī)分為:生肌象皮膏組、凡士林組、糖尿病對(duì)照組3個(gè)糖尿病潰瘍模型組,每組各32只。

    2.2 給藥 造模完成后用單籠飼養(yǎng)每組大鼠,自由飲水,常規(guī)飼料進(jìn)食。每日清晨祛除硬痂,常規(guī)消毒,用生理鹽水沖洗創(chuàng)面后換藥布1次。生肌象皮膏組用生肌象皮膏紗條外敷,凡士林組用凡士林紗條外敷,空白對(duì)照組及糖尿病對(duì)照組以生理鹽水紗條外敷。4組動(dòng)物創(chuàng)面均外用無(wú)菌紗布包扎,固定。

    2.3 取材 剔除死亡及未成模大鼠,每組分別于造模成功后 1、3、7、14、21 d 處死部分大鼠,采用股動(dòng)脈取血及手術(shù)取新鮮創(chuàng)面肉芽組織,用液氮分別冷藏各時(shí)間點(diǎn)樣本,保存?zhèn)溆?。造模成功主?shí)驗(yàn)完成各組死亡大鼠數(shù)量分別為生肌象皮膏組10只,凡士林組9只,糖尿病對(duì)照組10只,故最終納入生肌象皮膏組22只,凡士林組23只,糖尿病對(duì)照組22只。

    2.4 檢測(cè) 用SYBR GreenⅠReal-Time PCR方法檢測(cè)各組潰瘍組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。用超純RNA提取試劑提取組織樣本中總RNA,并進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測(cè),核酸在260 nm附近有強(qiáng)吸收,蛋白質(zhì)在280 nm附近有強(qiáng)吸收,利用此性質(zhì)使用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的A260/A280的比值,理想的RNA純度A260/A280應(yīng)在 1.9~2.1 范圍之間。取 5 μL RNA 用 1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,以檢測(cè)RNA的完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的gDNA Eraser對(duì)RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用ABI 7500型熒光定量PCR儀,根據(jù)Real-Time PCR原始檢測(cè)結(jié)果,按照 2-ΔΔCt相對(duì)定量計(jì)算公式,即 F=2-{[待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組管家基因平均Ct值]-[對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組管家基因平均Ct值]},計(jì)算出各樣本的目的基因相對(duì)定量結(jié)果。

    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示;組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間兩兩比較采用LSD法,P<0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    于造模成功后 1、3、7、14、21 d 提取出的各組糖尿病大鼠潰瘍組織中Ang-1、Tie-2 mRNA水平均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05),且生肌象皮膏組大鼠潰瘍組織中Ang-1、Tie-2 mRNA水平明顯高于凡士林組及糖尿病對(duì)照組(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表 2、3。各糖尿病模型組中Ang-2 mRNA水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05),且生肌象皮膏組 Ang-2 mRNA水平明顯低于糖尿病對(duì)照組(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表4。

    4 討論

    外傷潰瘍屬于中醫(yī)中的瘡瘍,創(chuàng)面膿液的多少在一定程度上影響了潰瘍愈合的速度[9],此為“偎膿長(zhǎng)肉”理論的概要。中醫(yī)治療的代表方為出自《瘍科綱要》的生肌象皮膏,其組成包括由象皮粉、當(dāng)歸、血余炭、龜板、生地、生爐甘石、生石膏、香油及白蠟。主藥為象皮,陳寶元等[10-12]對(duì)比含有及不含有象皮的兩種生肌膏在抗炎及免疫調(diào)節(jié)方面的藥理作用,考察了象皮在組方中的作用和地位。其研究結(jié)果顯示,含有象皮的組方與無(wú)象皮的組方在臨床療效方面有明顯的差別,表明象皮在生肌象皮膏中有其獨(dú)特的作用和地位。孫玉芝等[13]研究發(fā)現(xiàn),血余炭能較顯著增強(qiáng)血小板聚集作用,血余炭粗晶可進(jìn)促內(nèi)源性系統(tǒng)凝血,其止血原理與血漿中cAMP含量有關(guān),并能降低血小板內(nèi)環(huán)核苷酸含量,有一定的抗炎、抗菌作用。爐甘石收濕止癢斂瘡,可吸收創(chuàng)面分泌物,周靈君等[14]研究發(fā)現(xiàn)爐甘石通過(guò)改善創(chuàng)面的血液循環(huán)、加速創(chuàng)面的新陳代謝、促進(jìn)傷口成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管的形成,加快肉芽組織增生等方面的作用,加速皮膚創(chuàng)口的愈合。煅石膏收濕止血、生肌斂瘡,李祥等[15]對(duì)照煅石膏與生石膏的生肌藥效發(fā)現(xiàn),煅石膏治療組與生石膏治療組比較,大鼠創(chuàng)口成纖維細(xì)胞數(shù)、肉芽組織中毛細(xì)血管數(shù)和肉芽組織中毛細(xì)血管面積均顯著增加,表明煅石膏能夠促進(jìn)大鼠傷口成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管的形成,加快肉芽組織增生,從而加速皮膚創(chuàng)口的愈合。再配伍當(dāng)歸、生地、龜板三藥濡養(yǎng)受損皮膚,養(yǎng)血生津,生肌長(zhǎng)皮。

    表2 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中Ang-1 mRNA水平比較(x±s)Tab.2 Comparison of the level of Ang-1 mRNA in granulation tissue of rats in each group(x±s)μg/L

    表3 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中Ang-2 mRNA水平比較(x±s)Tab.3 Comparison of the level of Ang-2 mRNA in granulation tissue of rats in each group(x±s) μg/L

    表4 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中Tie-2 mRNA水平比較(x±s)Tab.4 Comparison of the level of Tie-2 mRNA in granulation tissue of rats in each group(x±s) μg/L

    在高糖條件下,炎癥反應(yīng)低下且呈階段性延長(zhǎng)、新生血管生長(zhǎng)緩慢、基質(zhì)蛋白水解酶呈高水平狀態(tài)、膠原合成減少、肉芽組織形成變慢等[16-17]。新生血管網(wǎng)的形成是創(chuàng)面修復(fù)的中心環(huán)節(jié)[18],只有形成豐富的新生血管網(wǎng),才能為組織修復(fù)提供所必須的氧及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),從而促進(jìn)創(chuàng)面微循環(huán),加速創(chuàng)面愈合。

    本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與既往研究觀點(diǎn)相一致,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示糖尿病皮膚潰瘍愈合困難可能與創(chuàng)面局部Ang-2表達(dá)水平持續(xù)升高及Ang-1、Tie-2表達(dá)水平下降有關(guān)。生肌象皮膏可抑制糖尿病創(chuàng)面肉芽組織中Ang-2的表達(dá),可能通過(guò)上調(diào)創(chuàng)面肉芽組織中Ang-1、Tie-2的表達(dá)水平,下調(diào)Ang-2的表達(dá)水平促進(jìn)糖尿病潰瘍面的愈合。Ang/Tie-2信號(hào)通路與血管生成密切相關(guān),其中Ang-1能夠促進(jìn)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞存活并維定狀態(tài)。同時(shí),Ang-2通過(guò)介導(dǎo)血管去穩(wěn)態(tài)化,拮抗Ang-1的作用靶點(diǎn),從而抑制血管生成、成熟與存活[19]。升高的Ang-2一方面導(dǎo)致炎癥過(guò)程延長(zhǎng),另一方面拮抗Ang-1的作用,導(dǎo)致新生毛細(xì)血管成熟障礙、滲透性增加、創(chuàng)面愈合慢。

    酪氨酸蛋白激酶受體-2(Tie-2)作為 Ang-1 和Ang-2的共同受體,Ang-1與其結(jié)合后,能夠促進(jìn)血管重塑以及新生血管的成熟,并進(jìn)一步維持血管內(nèi)皮的完整性[20]。另外,Ang-1/Tie-2還能夠通過(guò)阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子缺乏而發(fā)生的凋亡。在內(nèi)皮細(xì)胞中,Ang-2可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制Ang-1引起的Tie-2磷酸化,抑制血管周圍細(xì)胞的積聚,并拮抗Ang-1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),生肌象皮膏組Tie-2表達(dá)水平升高,提示生肌象皮膏可能通過(guò)促進(jìn)Tie-2的表達(dá)、增加Ang-1的受體數(shù)量,進(jìn)而增加創(chuàng)面肉芽組織中新生毛細(xì)血管的建立、成熟及穩(wěn)定,以此保證肉芽組織的血供,促進(jìn)潰瘍面的愈合。

    本實(shí)驗(yàn)以糖尿病潰瘍動(dòng)物模型為載體,從Ang/Tie-2通路表達(dá)促進(jìn)血管新生角度探討生肌象皮膏促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合的可能作用機(jī)制,同時(shí)也為中醫(yī)“偎膿長(zhǎng)肉”理論提供科學(xué)依據(jù)。

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